SIRT1/UCP2通路在脂肪变性HepG2细胞线粒体能量代谢中的调控机制

张玉佩　孔怡琳　杨钦河　邓远军　梁荫基　金　玲　何毅芳　李媛媛　王观龙　程少冰

(暨南大学医学院，广东　广州　510632)



SIRT1/UCP2通路在脂肪变性HepG2细胞线粒体能量代谢中的调控机制

张玉佩孔怡琳1杨钦河邓远军梁荫基金玲2何毅芳李媛媛王观龙程少冰

(暨南大学医学院，广东广州510632)

〔摘要〕目的采用油酸诱导HepG2细胞发生脂变，建立脂肪变性细胞模型，观察SIRT1/UCP2通路在脂肪变性HepG2细胞能量代谢中的调控机制。方法采用含有2 mmol/L油酸的DMEM培养基诱导HepG2细胞24 h后，建立脂肪变性HepG2细胞模型，并设置对照组比较。以油红O染色观察细胞内脂滴形成状况，并用全自动生化仪检测细胞上清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量和细胞内甘油三酯(TG)含量；采用流式细胞仪测定线粒体膜电位的改变，采用磷钼酸比色试剂盒测定细胞内三磷酸腺苷(ATP)含量，运用Western印迹法检测各组细胞SIRT1和UCP2蛋白的表达。结果与对照组比较，模型组细胞内橘红色脂滴大量形成，且TG含量明显升高(P<0.01)，线粒体膜电位及细胞内ATP含量显著降低(P<0.05，P<0.01)，SIRT1蛋白表达均显著降低(P<0.05)，UCP2蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论油酸诱导的脂肪变性HepG2细胞模型可以出现脂质代谢紊乱和线粒体能量代谢失衡，其机制可能与细胞内SIRT1/UCP2通路的激活有关。

〔关键词〕HepG2细胞；脂肪变性；SIRT1/UCP2通路；能量代谢

1广东省中医院大学城医院2暨南大学附属第一医院

第一作者：张玉佩(1982-)，男，硕士，实验师，主要从事中西医结合防治慢性肝病研究。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)均无过量饮酒史，以肝细胞弥漫性脂肪病变为主要特征的临床病理综合征。沉默信息调节因子(SIRT)1是一种依赖于NAD+的去乙酰化酶，属于表观遗传学中组蛋白修饰部分，可使多种蛋白质的赖氨酸残基发生去乙酰化〔1〕。SIRT1可以促进脂类物质大量被动员，并参与肝脏糖异生，同时影响着胰岛素的分泌功能，在NAFLD的防治研究中逐渐引起重视〔2〕。解耦联蛋白(UCP)2是一种哺乳动物所特有的线粒体内膜蛋白质，具有调节质子跨膜转运的作用，在NAFLD大鼠肝组织及脂肪变性肝细胞中UCP2基因和蛋白呈现高表达状态，与脂肪酸代谢关系密切〔3~5〕。本研究旨在观察脂肪变性HepG2细胞的脂质蓄积程度及SIRT1/UCP2通路与线粒体能量代谢之间的调控关系，以期在细胞水平探讨NAFLD的发病机制。

1材料和方法

1.1材料HepG2肝癌细胞株由暨南大学医学院生化教研室馈赠；胎牛血清、DMEM高糖培养基和0.25%胰蛋白酶购自美国hyclone公司；油酸购自美国sigma公司；油红O染色试剂盒、细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒和三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。日本日立公司全自动生化分析仪，OLMPUS荧光倒置显微镜。宁波新芝生物科技股份有限公司JY96-Ⅱ超声细胞粉碎机，奥地利TECAN公司Tecan-safire2全波长多功能酶标仪，美国BD FACSAriaTM Cell Sorter 流式细胞仪。

1.2方法

1.2.1HepG2细胞培养HepG2细胞常规培养于含10%胎牛血清DMEM高糖培养基中，培养条件为37℃，CO2浓度为5%。根据细胞生长情况，待细胞长至瓶壁80%~90%(约每2~3 d)，用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞并传代，实验中设置对照组和模型组，分别于6孔板中培养，每组各设6孔观察。

1.2.2HepG2细胞脂肪变性模型的建立将处于对数生长期的HepG2细胞接种于6孔培养板中，在37℃、5%CO2培养箱中孵育贴壁48 h后，更换新鲜培养液，参考Hwang等〔6〕的造模方法改进，予含2 mmol/L油酸的DMEM无血清培养基孵育HepG2细胞24 h，对照组为DMEM无血清培养基，油红O染色鉴定。

1.2.3全自动生化仪检测细胞上清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量变化细胞诱导成功后，将各培养孔中的细胞上清分别加入对应1.5 ml EP管中，用全自动生化仪检测培养上清中ALT、AST含量变化。

1.2.4全自动生化仪检测细胞内甘油三酯(TG)含量变化取完各孔细胞上清后，将细胞用PBS洗涤2遍，加入0.25%胰酶消化细胞，用含10%胎牛血清DMEM培养基终止消化，并吹打细胞(确保将各孔内的所有细胞吹下)，将各孔中的细胞悬液分别移入1.5 ml EP管中，离心(4℃，1 000 r/min，5 min)，弃上清；PBS洗涤细胞2遍，离心(4℃，1 000 r/min，5 min)，弃上清；将EP管置于冰上，每管各加入异丙醇300 μl；用超声细胞粉碎机裂解细胞3 min；裂解后，离心(4℃，3 000 r/min，5 min)，取上清，全自动生化仪检测上清中的TG含量。

1.2.5流式细胞术检测细胞线粒体膜电位变化采用JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位变化，细胞诱导成功后，经洗涤、消化，收集对照组和模型组的细胞，PBS重悬细胞，4℃离心5 min，弃上清，每管加入200 μl JC-1染液，混匀，37℃避光孵育15 min，离心(4℃，1 000 r/min，5 min)，弃上清，收集细胞，用500 μl 1×染色结合液洗2次，吸取500 μl 1×染色结合液重新悬浮细胞，混匀，在流式细胞仪上检测，分析平均荧光强度值(MIF)。

1.2.6磷钼酸比色法检测细胞内ATP含量变化细胞诱导成功后，经洗涤、消化，收集对照组和模型组的细胞，PBS重悬细胞，离心(4℃，1 000 r/min，5 min)，弃上清，每管加入300 μl热双蒸水，置于热水浴(95℃)中匀浆破碎15 min，后将细胞悬液置于沸水浴中加热10 min，取出涡旋混匀1 min，采用ATP含量测试盒(磷钼酸比色法)检测，全波长酶标仪测定各孔吸光度值，计算每管ATP浓度。

1.2.7Western印迹法检测细胞SIRT1和UCP2蛋白表达水平 取适量裂解液，使用前先加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使PMSF终浓度为1 mmol/L。计数细胞，按照每6×106个细胞加入1 ml RIPA裂解液，4℃离心5 min，根据碧云天BCA蛋白浓度试剂盒说明书对蛋白含量进行测定。HepG2细胞样本进行凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育、4℃过夜。洗涤后加入二抗，孵育，充分洗涤，然后进行化学发光、曝光、 显影、 定影，最后对结果进行光密度扫描分析。

1.3统计学处理采用SPSS17.0软件行t检验。

2结果

2.1油红O染色观察细胞内脂滴变化对照组：细胞体积较小，细胞边缘清晰，大部分细胞无明显橘红色脂滴蓄积，仅有少数细胞内有少量橘红色脂滴，颜色较淡；模型组：细胞明显肿大，胞膜轮廓模糊，细胞内可见较多橘红色脂滴，并出现脂滴融合现象，部分脂滴甚至融合呈链状或环状。见图1。

图1　油红O染色观察细胞内脂滴(×400)

2.2细胞上清ALT、AST含量变化与对照组〔(3.17±0.41)、(8.83±0.75)U/L〕比较，模型组在诱导24 h后，细胞上清中的ALT〔(3.33±0.52)U/L〕、AST〔(10.5±5.17)U/L〕含量呈上升趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3细胞内TG含量的变化与对照组〔(0.19±0.01)mmol/L〕比较，模型组的HepG2细胞内TG含量〔(0.29±0.04)mmol/L〕明显增高(P<0.01)。

2.4细胞线粒体膜电位的变化采用流式细胞仪检测细胞荧光激发的强度，绿色荧光强度越高、线粒体膜电位越低。结果表明：对照组MIF为9 636±558，模型组MIF为7 214.7±1 335.1，与对照组比较，模型组线粒体膜电位显著降低(P<0.05)。见图2。

图2　细胞线粒体膜电位变化

2.5细胞内ATP含量的变化与对照组〔(1 520.54±372.79)μmol/gprot〕比较，模型组ATP含量〔(949.8±193.76)μmol/gprot〕显著降低(P<0.01)。

2.6细胞SIRT1、UCP2蛋白表达水平与对照组(0.475 2±0.173 9、0.135±0.067)比较，模型组SIRT1蛋白表达(0.141 1±0.393 8)显著降低(P<0.05)，UCP2蛋白表达(0.653 4±0.123 8)显著升高(P<0.01)。见图3。

图3　各组HepG2细胞SIRT1 和 UCP2蛋白的表达

3讨论

无论在欧美还是亚洲，NAFLD已成为该地区发病率稳居前列的慢性肝病，且呈低龄化发病趋势〔7~9〕。研究表明NAFLD是糖脂代谢紊乱性疾病和心脑血管疾病发生的关键危险因素〔10，11〕，其发病危险指数呈快速上升的趋势。HepG2肝癌细胞株是体外脂肪变性细胞模型重要载体，与肝细胞相比，其具有生物学功能相似和对脂毒性的耐受能力更强的特点，是国内外诱导脂变模型使用最多的细胞〔12，13〕。

研究表明线粒体是脂肪酸进行β氧化、三羧酸循环、ATP合成和活性氧(ROS)形成的主要场所〔14〕，也是细胞代谢所需能量的主要来源，也是细胞内氧化应激的源头，肝脏脂质蓄积越严重，肝细胞线粒体功能损伤越明显〔15〕，线粒体呼吸链是ROS的主要来源，线粒体功能障碍会损害肝脏的脂肪稳态，引起ROS的过量释放，导致线粒体膜电位和呼吸链功能下降，ATP合成障碍〔16〕。线粒体膜流动性下降，脂肪在线粒体内产生堆积，脂肪酸产生直接脂毒性，可造成线粒体肿胀，降低线粒体内酶的活性，引起肝细胞线粒体功能障碍，从而诱导肝细胞的凋亡〔17〕。线粒体功能障碍还与脂质过氧化关系密切，线粒体生物膜的磷脂、酶和膜受体相关多聚不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质反应形成脂质过氧化产物如丙二醛和壬烯，其能够与线粒体蛋白结合和进一步损害线粒体呼吸链复合物，直接或间接的损害线粒体DNA，诱导线粒体产生更多ROS，形成恶性循环〔18〕。本实验采用流式细胞术观察到脂肪变性HepG2细胞线粒体膜电位明显降低，同时该组细胞较对照组ATP含量下降、TG含量增加。由此推测，油酸诱导的脂肪变性细胞模型可以引起细胞内脂肪酸代谢发生障碍，进而加重TG在细胞内的蓄积，引起细胞线粒体膜电位降低，能量代谢发生障碍。线粒体能量代谢障碍与NAFLD发生、发展关系密切〔19〕，SIRT1/UCP2通路是细胞脂质代谢和线粒体能量代谢调控的关键通路。SIRT1是一种核蛋白，能够作为转录因子抑制UCP2转录活性，SIRT1通过与UCP2启动子区的结合，抑制UCP2基因的表达，减少其编码的线粒体内膜蛋白的生成，从而抑制线粒体中解偶联反应的发生〔20〕。在解偶联状态下，H+途径ATP合成旁路从线粒体膜外重新进入膜内，从而抵消跨膜质子的电化学梯度，使线粒体产生氧化磷酸化解偶联作用，阻止细胞内线粒体通过呼吸方式将能量合成为ATP〔21〕。Della-Morte等〔22〕发现白藜芦醇可以通过活化SIRT1，抑制UCP2的表达，改善线粒体能量代谢，从而在脑缺血损伤大鼠中发挥神经保护的作用。本研究结果提示油酸成功诱导HepG2细胞脂肪变性后，SIRT1蛋白对UCP2蛋白的调控作用受到抑制，线粒体解耦连效率降低，线粒体膜电位下降，从而使能量代谢发生障碍，由此可见，在NAFLD发病过程中，SIRT1/UCP2通路可能在线粒体能量代谢过程中发挥关键作用，并且未来可能成为防治NAFLD的潜在靶点。

4参考文献

1Colak Y，Yesil A，Mutlu HH，etal.A potential treatment of non-alcoholic fatty liver disease with SIRT1 activators〔J〕.Gastrointest Liver Dis，2014；23(3)：311-9.

2徐静，李楠，王俊红，等.2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠肝脏SIRT1、UCP2表达的变化〔J〕.南方医科大学学报，2012；32(5)：726-33.

3Zou X，Yan CH，Shi YJ，etal.Mitochondrial dysfunction in obesity-associated nonalcoholic Fatty liver disease：the protective effects of pomegranate with its active component punicalagin〔J〕.Antioxid Redox Signal，2014；21(11)：1557-70.

4Yang QH，Hu SP，Zhang YP，etal.Effect of berberine on expressions of uncoupling protein-2 mRNA and protein in hepatic tissue of non-alcoholic fatty liver disease in rats〔J〕.Chin J Integr Med，2011；17(3)：205-11.

5Ma ST，Yang DC，Li D，etal.Inhibition of uncoupling protein 2 with genipin exacerbates palmitate-induced hepatic steatosis〔J〕.Lipids Health Dis，2012；11(1):154.

6Hwang YJ，Wi HR，Kim HR，etal.Pinus densiflora Sieb.et Zucc.alleviates lipogenesis and oxidative stress during oleic acid-induced steatosis in hepG2 cells〔J〕.Nutrients，2014；6(7)：2956-72.

7Loomba R，Sanyal AJ.The global NAFLD epidemic〔J〕.Nature Rev Gastroenterol Hepatol，2013；10(11)：686-90.

8Wattacheril J，Naga Chalasani MPH.Nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD)：is it really a serious condition〔J〕?Hepatology,2012；56(4)：1580-4.

9Wong VWS.Nonalcoholic fatty liver disease in Asia：a story of growth〔J〕.J Gastroenterol Hepatol，2013；28(1)：18-23.

10Welsh JA，Karpen S，Vos MB.Increasing prevalence of nonalcoholic fatty liver disease among United States adolescents，1988-1994 to 2007-2010〔J〕.J Pediatr，2013；162(3)：496-500.

11Berardis S，Sokal E.Pediatric non-alcoholic fatty liver disease：an increasing public health issue〔J〕.Eur J Pediatr，2014;173(2)：131-9.

12Hwang YP，Kim HG，Choi JH，etal.S-allyl cysteine attenuates free fatty acid-induced lipogenesis in human HepG2 cells through activation of the AMP-activated protein kinase-dependent pathway〔J〕.J Nutr Biochem，2013；24：1469-78.

13胡义扬，张慧，陈少东，等.一种用于脂肪肝脂毒性药理研究的体外模型〔J〕.中华肝脏病杂志，2008；16(2)：121-4.

14Matthew Morris E，Scott Rector R，Thyfault JP，etal.Mitochondria and redox signaling in steatohepatitis〔J〕.Antioxid Redox Signal，2011；15(2)：485-504.

15Mantena SK，King AL，Andringa KK，etal.Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in the pathogenesis of alcohol-and obesity-induced fatty liver diseases〔J〕.Free Rad Biol Med，2008；44：1259-72.

16Paradies G，Paradies V，Ruggiero FM，etal.Oxidative stress，cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease〔J〕.World J Gastroenterol，2014；20：14205-18.

17McKenzie M，Liolitsa D，Michael G,etal.Mitochondrial disease：mutations and mechanisms〔J〕.Neurochem Res，2004；29(3)：589-600.

18Landar A，Zmijewski JW，Dickinson DA，etal.Interaction of electrophilic lipid oxidation products with mitochondria in endothelial cells and formation of reactive oxygen species〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006；59(5)：H1777-H87.

19Betancourt AM，King AL，Fetterman JL，etal.Mitochondrial-nuclear genome interactions in non-alcoholic fatty liver disease in mice〔J〕.Biochem J，2014；461(2)：223-32.

20Laura Bordone，Maria Carla Motta，Frederic Picard，etal.Sirt1 regulates insulin secretion by repressing UCP2 in pancreatic β cells〔J〕.PLoS Biol，2006；4(2)：e31.

21Emre Y，NT.Uncoupling protein UCP2：When mitochondrial activity meets immunity〔J〕.FEBS Lett，2010；584(8)：1437-42.

22Della-Morte d，Dave kr，DeFazio RA，etal.Resveratrol pretreatment protects rat brain from cerebral ischemic damage via a sirtuin1-uncoupling protein 2 pathway〔J〕.Neuroscience，2009；159(3)：993-1002.

〔2015-09-14修回〕

(编辑袁左鸣)

Regulatory mechanism of SIRT1/UCP2 pathway in mitochondrial energy metabolism of steatotic HepG2 cells

ZHANG Yu-Pei, KONG Yi-Lin, YANG Qin-He,etal.

Medical College, Jinan University, Guangzhou 510632，Guangdong, China

【Abstract】ObjectiveTo establish a steatotic HepG2 cell model induced by oleic acid, and observe the regulatory mechanism of SIRT1/UCP2 pathway in energy metabolism of steatotic HepG2 cells.MethodsInduced by DMEM medium of 2 mmol/L oleic acid for 24 hours, the steatotic HepG2 cell model was successfully established.Then, lipid droplets in cytoplasm were observed by oil red O staining, while alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) in serum, and triglyceride (TG) accumulation in HepG2 cells were measured by automatic biochemical analyzer. The changes of mitochondrial membrane potential were determined by flow cytometry, and intracellular adenosine triphosphate(ATP) level was detected by biological reagent kit. The protein expressions of SIRT1 and UCP2 were analyzed by Western blot.ResultsCompared with those of control group, the level of TG accumulation was significantly higher(P<0.01), and lots of red lipid droplets inside cytoplasm were visible, while mitochondrial membrane potential and intracellular ATP levels were significantly reduced(P<0.05，P<0.01) in model group. The expression of SIRT1 protein was significantly lower(P<0.05), whereas the expression of UCP2 protein was significantly higher(P<0.01) in model group.ConclusionsThe oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells might result in lipid metabolism disorder and mitochondrial dysfunction, possibly by activating the SIRT1/UCP2 pathway in HepG2 cells.

【Key words】HepG2 cells; Steatosis; SIRT1/UCP2 pathway; Energy metabolism

通讯作者：杨钦河(1961-)，男，博士，教授，主任医师，博士生导师，主要从事中西医结合防治慢性肝病及脂代谢疾病研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81302878，81273617)；中国肝炎防治基金会天晴肝病研究基金(No.cfhpc20132184)；暨南大学第一临床医学院科研培育专项基金(No.2014205)；广东省中医药局项目(No.20151224);广东省医学科研基金项目(No.A2015521)

〔中图分类号〕Q493.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0513-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.001

·基础研究·