体外受精中1PN及0PN(2PB)胚胎发育潜能及影响因素分析

张亚楠，殷宝莉，张翠莲，韦多，郝好英，宋小兵，谢娟珂

(郑州大学人民医院生殖医学研究所/河南省人民医院生殖医学研究所，郑州　450003)



体外受精中1PN及0PN(2PB)胚胎发育潜能及影响因素分析

张亚楠，殷宝莉，张翠莲*，韦多，郝好英，宋小兵，谢娟珂

(郑州大学人民医院生殖医学研究所/河南省人民医院生殖医学研究所，郑州450003)

【摘要】目的初步探讨体外受精-胚胎移植周期中1PN及0PN(2PB)胚胎形成的影响因素和发育潜能，以探寻提高卵母细胞利用率的可行性方法。方法对787个IVF周期和298个ICSI周期患者授精后18～20 h观察到的1PN及0PN(2PB)胚胎继续进行体外培养，观察其原核及卵裂情况，序贯培养至D6，观察囊胚形成情况；并回顾性分析这些患者的临床资料，研究1PN及0PN(2PB)胚胎形成的影响因素。结果(1)1PN及0PN(2PB)胚胎可卵裂并形成囊胚，但卵裂率(分别为90.16%和88.11%)和囊胚形成率(17.09%和30.03%)均显著低于2PN胚胎(分别为98.40%和45.71%)(P均<0.05)；(2)1PN胚胎的形成随患者的年龄、体外受精方式及获卵数的不同而不同，而0PN(2PB)胚胎的形成只随患者年龄不同而异(P<0.05)；(3)经Logistic回归分析发现，1PN和0PN(2PB)胚胎的形成与患者选择的受精方式、MII卵数、2PN胚胎数相关(P<0.05)，而与患者的年龄、体重指数、基础内分泌水平及获卵数无关(P>0.05)。结论患者的体外受精方式、获得的MII卵数以及受精后的2PN胚胎数可能影响到1PN和0PN(2PB)胚胎的形成；1PN及0PN(2PB)胚胎有一定发育潜能，但较2PN胚胎低；在行辅助生殖技术助孕过程中，应综合考虑各种影响因素，以降低1PN和0PN(2PB)胚胎的发生率，提高卵母细胞的临床利用率。

【关键词】体外受精；单原核(1PN)胚胎；囊胚；发育潜能；Logistic回归

(JReprodMed2016，25(1)：32-38)

在人类体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术中，常于授精后16～20 h内通过光学显微镜对胚胎原核数目进行观察及评分，正常受精的判断标准为观察到胚胎内存在明确的2PN(pronucleus)及2PB(polar body)[1]。然而，在胚胎培养过程中，常有相对较多的异常受精情况出现，其中1PN的发生率约为2%～5%[2]。在临床治疗过程中，1PN及0PN(2PB)胚胎通常被视为异常受精胚胎，与多原核胚胎及发育停滞的2PN胚胎一起作为废弃胚胎被销毁。事实上，部分1PN及0PN(2PB)胚胎是正常受精的胚胎，只是因为错过了最佳的观察时机[3]，被误认为是异常受精，如果将这类胚胎全部销毁，会造成胚胎资源的浪费。

本研究回顾性分析787个IVF周期和298个ICSI周期患者的1PN及0PN(2PB)胚胎的继续培养情况，探讨这类“异常受精”胚胎的发育潜能，同时分析患者的临床资料，研究1PN及0PN(2PB)胚胎形成的影响因素，为降低1PN及0PN(2PB)胚胎的发生率，提高卵母细胞利用率提供指导。

资料与方法

一、临床资料

选择2014年7月28日至2014年10月31日就诊于河南省人民医院生殖中心的不孕症夫妇的临床资料。

纳入标准：基础内分泌水平正常；≤3个治疗周期；HBV及HIV阴性。

排除标准：生殖泌尿系统急性感染或性传播疾病；严重的遗传、躯体疾病或精神疾患；吸毒等不良嗜好；获卵数<1个；短时受精联合早期补救ICSI(Re-ICSI)。

本研究共包括787个IVF周期和298个ICSI周期的不孕症夫妇的临床资料。

二、患者诊疗方法回顾

1.促排卵方案及卵母细胞的采集与处理：接受IVF-ET治疗的不孕症患者采用本中心常规方案[4]进行控制性促排卵，当≥3个卵泡直径达18 mm时，结合血清雌二醇(E2)、孕酮(P)值，适时予以HCG(丽珠制药)5 000～10 000 U肌肉注射；36 h后在阴道超声引导下，使用18 G取卵针(Cook，瑞典)采集卵冠丘复合体(OCCC)，将其于加有G-MOPS缓冲液(Vitrolife，瑞典)的培养皿中洗涤两次后，转入含G-IVF-PLUS培养液(Vitrolife，瑞典)的培养皿中，置于37℃、体积分数6% CO2、体积分数5% O2的饱和湿度培养箱中培养。

2.精子处理： 精液处理采用密度梯度离心法。处理后的精子沉淀经1 ml的G-IVF-PLUS培养液(Vitrolife，瑞典)上游后，取上游液分析精子浓度。

3.受精：IVF周期患者于取卵后约3 h后行体外授精，加精浓度为每卵0.5～1万条精子；精卵共孵育约4 h后机械剥离颗粒细胞，转入含有G1-PLUS培养液(Vitrolife，瑞典)的培养皿中。

ICSI周期患者于取卵后约3 h后将孵育后的卵母细胞经透明质酸酶(Vitrolife，瑞典)消化后机械剥离颗粒细胞，将卵母细胞置于含有G-IVF-PLUS培养液(Vitrolife，瑞典)的培养皿中预培养1 h后，挑选形态相对正常的精子对成熟的卵母细胞行单精子注射，注射后的卵母细胞转入含G1-PLUS培养液(Vitrolife，瑞典)的培养皿中培养。

4.胚胎观察及评分：授精后18～20 h于倒置显微镜下观察受精情况，记录原核数目。原核和胚胎形态学的观察参照之前的研究[5]。若观察时胚胎出现两个原核及两个极体，则为2PN胚胎；若只有一个原核，则为1PN胚胎；若观察不到原核但有两个极体，则为0PN(2PB)胚胎。

2PN胚胎于D2和D3在倒置显微镜下评估卵裂期胚胎的形态，包括胚胎细胞数、碎片比例、细胞大小是否均匀等情况，参照文献标准[6]。可利用胚胎为细胞数多于4个且评分高于2分的胚胎，可继续培养至囊胚；根据患者的具体情况决定其2PN胚胎的去向：移植、冷冻或是囊胚培养。进行囊胚培养的2PN胚胎，于D5和D6对囊胚进行评估，囊胚分级的方法为Gardner囊胚分级法[7]。我中心可利用囊胚标准为：3BB及以上的囊胚；优质囊胚标准为：评分为4AA、4AB、4BA和4BB的囊胚；可利用囊胚及优质囊胚可进行移植或冷冻保存，冷冻的囊胚择期复融后进行移植。

临床上常规将1PN胚胎及0PN(2PB)胚胎丢弃。本研究中所有的1PN及0PN(2PB)胚胎均进行序贯培养，培养至D6，胚胎及囊胚的评分标准同上。

上述整个过程均取得患者的知情同意且获得医院伦理委员会的批准。

三、观察指标

2PN胚胎形成率=(2PN胚胎数/获卵数)×100%；2PN胚胎卵裂率=(发生卵裂的2PN胚胎数/2PN胚胎数)×100%；2PN囊胚形成率=(2PN胚胎形成的囊胚数/进行囊胚培养的2PN胚胎数)×100%。

相应的1PN及0PN(2PB)胚胎的形成率、卵裂率、囊胚形成率采用类似计算方式。

四、统计学处理

所有数据采用SPSS17.0软件进行统计学处理。数据结果以均数±标准差(±s)或率(%)表示，组间两两比较采用LSD-t检验，率的比较采用χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、患者基本情况分析

787例行IVF治疗的患者，年龄为(31.94±5.63)岁，患者的体重指数(BMI)为(23.26±3.65)kg/m2；298例行ICSI治疗的患者，年龄为(32.11±6.86)岁，患者的BMI为(23.02±7.52)kg/m2。两组患者的基本资料和基础内分泌水平均无统计学差异(P>0.05)(表1)。

IVF治疗周期共415个周期进行了移植，共移植了760个2PN胚胎，临床妊娠241例；ICSI治疗周期有164个周期移植了264个2PN胚胎，临床妊娠102例。

二、1PN及0PN(2PB)胚胎形成及继续囊胚培养结局

370个IVF周期的患者出现了1PN和0PN(2PB)胚胎。形成1PN胚胎305枚，卵裂275枚，形成囊胚47枚；0PN(2PB)胚胎412枚，卵裂363枚，形成囊胚109枚。1PN和0PN(2PB)胚胎的卵裂率及囊胚形成率均显著低于2PN胚胎(P<0.05)(表2)

表1患者一般情况(x-±s)

组 别周期数年龄(岁)BMI(kg/m2)FSH(U/L)LH(U/L)IVF78731.94±5.6323.26±3.658.33±1.586.03±2.11ICSI29832.11±6.8623.02±7.527.55±3.115.71±2.43组 别周期数E2(pmol/L)P(nmol/L)PRL(nmol/L)T(nmol/L)IVF787238.04±297.562.42±2.890.91±0.562.36±0.90ICSI298224.38±259.362.64±1.690.82±0.672.22±0.59

表2IVF周期不同受精状况的胚胎体外继续培养情况[n(%)]

组 别形成率卵裂率囊胚培养数囊胚形成率1PN305(3.65)*275/305(90.16)*27547/275(17.09)*0PN(2PB)412(4.93)*363/412(88.11)*363109/363(30.03)*2PN4994(59.79)4914/4994(98.40)2133975/2133(45.71)

注：表中2PN和1PN、0PN分别表示2PN胚胎、1PN胚胎和0PN(2PB)胚胎；与2PN组相比，*P<0. 05

61个ICSI周期的患者形成了1PN和0PN(2PB)胚胎。其中1PN胚胎71枚，卵裂66枚，形成囊胚5枚；2PB胚胎25枚，卵裂21枚，形成囊胚3枚。

三、女方年龄与1PN及0PN(2PB)胚胎形成的关系

女方年龄范围为20～49岁，中位数为31岁，以30岁、35岁为界值对患者进行分组。与>35岁组患者比较，30～35岁组患者的2PN胚胎卵裂率、0PN(2PB)胚胎形成率及其卵裂率较高，且差异有统计学意义(P<0.05)，而<30岁组患者的0PN(2PB)胚胎卵裂率较高，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

四、体外受精方式与1PN及0PN(2PB)胚胎形成的关系

体外受精-胚胎移植周期中，常规IVF周期的平均获卵数、1PN及0PN(2PB)胚胎的发生率均高于ICSI周期(P<0.05)；而两组之间的1PN及0PN(2PB)胚胎的卵裂率及囊胚形成率并无显著性差异(P>0.05)(表4)。

五、获卵数与1PN及0PN(2PB)胚胎形成的关系

获卵数的中位数为9枚(1～48枚)，以5、10、15、20为界值，对患者进行分组。各组的1PN胚胎形成率及卵裂率以及0PN(2PB)胚胎的形成率均无统计学差异(P>0.05)，但各组之间2PN胚胎的形成率及卵裂率、0PN(2PB)卵裂率及2PN优质胚胎率存在显著性差异(P<0.05)(表5)。

六、Logstic回归分析结果

以是否有1PN胚胎形成为因变量，纳入患者年龄、体重指数、基础内分泌(FSH、LH、E2、PRL、P、T)水平、受精方式、获卵数、MII数、正常受精数为自变量，进行Logistic回归分析，以α=0.05为检验水准，P<0.05认为差异有统计学意义。

分析发现，1PN胚胎的形成与患者选择的受精方式、MII卵数、2PN数显著相关(P<0.05)，而与患者的年龄、体重指数、基础内分泌(FSH、LH、E2、PRL、P、T)水平、获卵数等无关(P>0.05)。与IVF周期相比，ICSI周期中更可能出现1PN胚胎(P<0.05)；当患者的MII卵数越多，2PN胚胎数越少时，越易形成1PN胚胎(P<0.05)。

同样，以是否有0PN(2PB)胚胎形成为因变量，进行Logistic回归分析，发现0PN(2PB)胚胎的形成与患者选择的受精方式、MII卵数、2PN数有关(P<0.05)，而与患者的年龄、体重指数、基础内分泌(FSH、LH、E2、PRL、P、T)水平、获卵数等无关(P>0.05)。与ICSI周期相比，IVF周期中更可能出现0PN(2PB)胚胎(P<0.05)；当患者的MII卵数越多，2PN胚胎数越少时，越易形成0PN(2PB)胚胎(P<0.05)。

表3女方年龄与IVF/ICSI周期中各类胚胎的发生发育关系[n(%)]

年龄组获卵数2PN形成率2PN卵裂率1PN形成率1PN卵裂率0PN形成率0PN卵裂率<3064723814(58.93)3751(98.35)200(3.09)182(91.00)228(3.52)202(88.60)*30~3531101868(60.06)1847(98.88)*117(3.76)103(88.03)152(4.89)*139(91.45)*>3517051004(58.89)980(97.61)59(3.46)56(94.92)57(3.34)43(75.44)

注：表中2PN和1PN、0PN分别表示2PN胚胎、1PN胚胎和0PN(2PB)胚胎；与>35岁组比较，*P<0.05

表4不同受精方式下各类胚胎的发生发育情况[n(%)]

组 别周期数平均获卵数1PN发生率1PN卵裂率1PN囊胚形成率0PN发生率0PN卵裂率0PN囊胚形成率IVF78710.61*305(3.65)*275(90.16)47(17.09)412(4.93)*363(88.11)109(30.03)ICSI2989.8571(3.01)66(92.96)5(7.58)25(1.07)21(84.0)3(14.29)

注：表中1PN和0PN分别表示1PN胚胎和0PN(2PB)胚胎；与ICSI组比较，*P<0.05

表5不同获卵数组中各类胚胎的发生发育情况[n(%)]

获卵数病例数2PN形成率2PN卵裂率1PN形成率1PN卵裂率≤5295510(62.65)494(96.86)25(3.07)21(84.00)6~103051355(56.58)*1339(98.82)*84(3.51)77(91.67)11~152361758(58.72)*1740(98.98)*※95(3.17)89(93.68)16~201371413(59.27)1389(98.30)70(2.94)63(90.00)21~481121650(69.92)#1616(97.94)102(4.32)91(89.22)获卵数病例数0PN形成率0PN卵裂率2PN优质胚胎率≤529534(4.18)23(67.65)#423(82.94)6~10305110(4.59)97(88.18)1087(80.22)*11~15236128(4.28)114(89.06)1412(80.32)*※16~2013793(3.90)82(88.17)1129(79.90)*21~4811272(3.05)68(94.44)1355(82.12)

注：表中2PN和1PN、0PN分别表示2PN胚胎、1PN胚胎和0PN(2PB)胚胎；与获卵数≤5组比较，*P<0. 05；与其他各组比较，#P<0. 05；与获卵数21～48组比较，※P<0.05

讨论

目前国内外学者认为1PN胚胎可能的发生机制主要有以下方面：①孤雌激活；②精子染色体解聚异常[8]；③雌原核形成异常[9]；④雌雄原核融合[10]；⑤雌雄原核形成不同步[11]；⑥成熟前原核核膜崩解(premature pronuclear envelope breakdown，pPNBD)：最近一项新的研究[12]发现，对1PN胚胎行FISH检测发现其有两个原核，这是以上的机制难以解释的，进一步采用免疫细胞化学检测，证实了pPNBD的发生可能是导致1PN胚胎形成的另一机制。另外，约30%～40%的卵受精18～20 h后在倒置显微镜下观察不到原核，只看到两个第二极体即0PN(2PB)胚胎。继续观察发现，部分0PN(2PB)胚胎仍可发生卵裂或是形成胚胎，其外观形态和卵裂率与正常受精的胚胎相似，因此未观察到原核并不意味着未发生受精。导致0PN(2PB)形成的原因主要有以下几个方面：①雌雄原核发育不同步[2]；②受精缺陷[13]；③第二极体参与到核遗传物质的形成过程[14]。从上述机制可以发现，部分1PN及0PN(2PB)胚胎是正常受精的胚胎，只是因为错过了最佳的观察时机[3]而导致只观察到1个原核或是没有原核，尽管如此，仍有一部分是异常受精的胚胎。临床上经常会遇到一些患者，获卵数较少，经过体外受精后往往无2PN胚胎，而形成了1PN或0PN(2PB)胚胎。对于此类患者，可进行多次原核观察，以期发现第二个原核。但反复多次地将培养皿取出进行观察会带来胚胎生长环境的不断变化，可能会对胚胎的正常发育造成一定的不良影响；此外，多次观察会大大地增加胚胎实验室工作人员的工作量。而近些年来兴起的time-lapse技术虽然可以在封闭环境下动态地观察胚胎发育情况，但因其价格昂贵且不能有效地改善妊娠结局及辅助生殖技术的安全性[15]，尚未在各个生殖中心广泛采用。所以本研究将探讨这类胚胎的发育潜能及可能的影响因素。

在本研究中，1PN胚胎的发生率为3.65%(IVF周期)、3.01%(ICSI周期)，与先前报道的2%～5%相似[2]。与正常的2PN胚胎相比，1PN胚胎的形成在患者基本情况、促排卵方案、胚胎发育情况等方面均无统计学差异[11]。目前有多个研究对获卵数与ART妊娠结局之间的关系进行研究，但研究结果并不一致。有研究证明，1PN胚胎的周期中卵冠丘复合体的数目较多[16]。我们根据获卵数的多少对患者进行分组，各组的1PN胚胎形成率及卵裂率以及0PN(2PB)胚胎的形成率均无显著差异，但2PN的形成率及卵裂率、0PN(2PB)胚胎卵裂率及2PN优质胚胎率则存在显著差异。本研究还发现1PN胚胎的形成可能与MII卵母细胞数及本周期中形成的2PN胚胎数相关，当患者本周期的MII卵母细胞数较多而2PN胚胎数目较少时，往往更可能会出现1PN胚胎。因为就每个周期的MII卵母细胞而言，授精后会形成0PN(2PB)胚胎、1PN胚胎、2PN胚胎、多PN胚胎，以及1PB胚胎，当MII卵母细胞数目较多，而其余各种类型的胚胎尤其是2PN胚胎较少时，则较易出现1PN胚胎。

母方年龄在体外受精-胚胎移植周期中起着关键性的作用。本研究发现，随着女方年龄的不断增长，IVF及ICSI授精方式下1PN胚胎的发生率与卵裂率无统计学差异，而30～35岁的患者0PN(2PB)的发生率较其他年龄组高。为了进一步探讨授精方式对1PN胚胎形成的影响，对患者进行分组研究结果显示，IVF授精方式下1PN及0PN(2PB)胚胎的发生率均高于ICSI组(P<0.05)，而两组的卵裂率及囊胚形成率并无显著性差异。这说明两种授精方式下1PN来源胚胎的发育潜能无统计学差异。有研究[17]表明，对IVF和ICSI周期中1PN胚胎进行荧光原位杂交(FISH)后发现，IVF周期中由1PN胚胎发育来的胚胎，其胚胎性染色体二倍体率为54.35%，单倍体率为23.91%，嵌合体率为21.74%；而在ICSI周期中，分别为34.62%、34.62%和30.77%。这表明IVF周期的单原核孕卵有一定的移植价值，而ICSI中1PN胚胎中大部分是由于孤雌生殖而形成。到目前为止，已有不少来源于1PN或0PN(2PB)胚胎来源的健康子代出生[18]。

进一步行Logistic回归分析发现，1PN及0PN(2PB)胚胎的形成与女方的年龄、体重指数、基础内分泌(FSH、LH、E2、PRL、P、T)水平及获卵数无关，而与患者选择的受精方式、MII卵数以及形成的2PN数有关。出现这一结果的原因可能与进行Logistic回归分析时选择的自变量有限有关，本研究未对患者的不孕类型(原发不孕或是继发不孕)、超促排卵方案、HCG日的FSH及E2水平、Gn用量等进行分析，也未将这些因素纳入到研究中，可能会导致结果的偏差。但Logistic回归分析的结果有统计学意义，并不代表从专业知识角度也有意义，所以1PN及0PN(2PB)胚胎形成的危险因素尚需进一步的研究。

有研究认为1PN胚胎极有可能存在染色体异常，胚胎质量较差，发育潜能较低，多数胚胎存在发育停滞，只有约30%发育至桑椹胚或囊胚[16，19]，故认为其不具有临床价值，常作为废胚丢弃，仅在个别无正常受精的2PN胚胎的情况下考虑使用。本研究对IVF/ICSI周期授精后18～20 h观察到的1PN及0PN(2PB)胚胎进行体外培养至D6，并于D5、D6观察其囊胚形成情况，发现1PN和0PN(2PB)胚胎有相当比例可发育成囊胚，但与2PN胚胎相比，其卵裂率及囊胚形成率均明显降低，说明1PN及0PN(2PB)胚胎具有一定的发育潜能，但发育潜能较低，与以往的研究结果相似。

综上所述，1PN和0PN(2PB)胚胎具有一定的发育潜能，其形成可能受授精方式、MII卵母细胞数等因素的影响。本研究并未对这些“异常胚胎”进行染色体分析，也并未对患者移植这些胚胎。因此，关于IVF-ET中单原核来源的胚胎是否具有利用价值，尚需进一步的研究来证实。

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[编辑：罗宏志]

Development potential of mono-pronucleus or two polar body zygotes and affecting factors in IVF

ZHANGYa-nan，YINBao-li，ZHANGCui-lian*，WEIDuo，HAOHao-ying，SONGXiao-bing，XIEJuan-ke

MedicalReproductionCenter，People’sHospitalofZhengzhouUniversity/HenanProvincialPeople’sHospital，Zhengzhou450003

【Abstract】

Objective： To investigate the affecting factors for formation of mono-pronucleus and two polar bodies zygotes and their development potential in IVF and ICSI.

Methods： Mono-pronucleus (1PN) or two polar body (2PB) zygotes were obtained from 298 patients in ICSI cycles and 787 patients in IVF cycles were observed at 18-20 hours after fertilization. The 1PN or 2PB zygotes were continuously cultured to Day 6 by the sequential method，and the pronuclear，cleavage and blastocyst were recorded. The data of the patients were retrospectively analyzed respectively to explore the influencing factors.

Results： The cleavage rate (90.16% and 88.11%) and blastocyst rate (17.09% and 30.03%) of 1PN and 2PB zygotes are significantly lower than that of 2PN embryos (98.40%，45.71%) (allP<0.05). The age of women，the fertilization modes and the number of oocytes retrieved significantly influenced the incidence of 1PN，while only the age significantly affected the incidence of 2PB zygotes (allP<0.05). Logistic regression analysis found that the incidence of 1PN or 2PB zygotes was significantly correlated with the fertilization modes，the number of MII oocytes and 2PN embryos (P<0.05)，but not with the age，body mass index，number of oocytes retrieved and serum levels of LH，FSH，E2，progesterone and PRL (P>0.05).

Conclusions： The developmental potential of 1PN or 2PB zygotes is much lower than 2PN embryos. Multiple factors such as the fertilization modes，number of MII oocytes，number of 2PN embryos may influence the incidence of 1PN or 2PB zygotes. The affecting factors should be considered in assisted reproductive techniques to reduce incidence of 1PN or 2PB zygotes and improve the utilization of oocytes.

Key words：IVF；Mono-pronucleus zygotes；Blastocyst；Developmental potential；Logistic regression analysis

【作者简介】张亚楠，女，河南漯河人，硕士，生殖医学专业.(*通讯作者)

【基金项目】河南省科技厅重点科技攻关项目(No.12202310536);河南省医学科技攻关项目(No.201202022)

【收稿日期】2015-07-18；【修回日期】2015-08-11

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.1.007