TLR2和TNF-α与输卵管炎的相关性研究

陈晓，王凤伟

(1.金华市人民医院生殖中心，金华　321000；2.武义县中医院，金华　321200；3.浙江大学医学院附属妇产科医院中心实验室，杭州　310012)



TLR2和TNF-α与输卵管炎的相关性研究

陈晓1，2*，王凤伟3

(1.金华市人民医院生殖中心，金华321000；2.武义县中医院，金华321200；3.浙江大学医学院附属妇产科医院中心实验室，杭州310012)

【摘要】目的建立输卵管炎模型，检测Toll样受体-2(TLR2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达，探讨其与输卵管炎的关系。方法48只6～8周龄BALB/c雌性小鼠，随机平均分为空白组(不处理)和模型组(子宫底注入l×109/ml金黄色葡萄球菌悬液50 μl)。分别在接种3 d、7 d、14 d、28 d处死模型组和对应时间的空白组小鼠，收集血液和输卵管。采用实时荧光定量PCR检测输卵管组织TLR2 mRNA以及ELISA检测血TNF-α在模型组和相应空白组中的表达，并观察各组输卵管病理改变。结果空白组各时间点输卵管组织TLR2 mRNA表达及血TNF-α浓度均无显著差异(P>0.05)；模型组3 d、7 d、14 d时TLR2 mRNA表达逐渐降低，TNF-α浓度逐渐升高，但均无统计学差异(P>0.05)，而28 d时TLR2 mRNA相对表达含量(0.822)显著低于3 d时(1.296)(P<0.05)；模型组各时间点血清TNF-α水平均显著高于相应空白组(P<0.05)。结论TLR2可能通过一系列信号转导，诱导产生大量TNF-α，引起输卵管炎。

【关键词】Toll样受体-2；肿瘤坏死因子-α；输卵管炎

(JReprodMed2016，25(1)：56-60)

临床术后输卵管炎大多是由革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌感染所致[1]。在炎症发生发展过程中，机体的免疫功能在炎性疾病的预后上起着重要的作用。Toll样受体 (Toll like receptors，TLRs)是与固有免疫密切相关的病原识别受体，可介导免疫防御[2]，Toll样受体-2(TLR2)在输卵管中表达最高[3]。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是由活化的单核-巨噬细胞产生和分泌的多肽类物质，与机体免疫反应以及炎症反应密切相关。本研究拟通过检测小鼠输卵管组织中TLR2和TNF-α的表达，探讨两者与输卵管炎的关系。

材料与方法

一、材料

1.实验动物：48只6～8周龄BALB/c雌性小鼠，体重16～20克。购买于浙江中医药大学动物实验中心(合格证号2007000580086)，均为清洁级，分笼颗粒饲料饲养，每只动物作上标记，饲养在浙江大学医学院附属第二医院动物实验中心清洁级动物房，温度18℃～24℃，光暗周期12 h。

2.造模菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)，由浙江大学医学院附属妇产科医院微生物室培养和提供，用无菌生理盐水稀释，配成浓度为1×109/ml的致病菌悬液。

3.实验试剂：总RNA提取试剂盒、cDNA转录试剂盒、PCR扩增试剂盒(大连宝生物)；TLR2、荧光定量PCR试剂(Takara，日本)；TLR2及β-actin引物(上海生工)；TNF-α ELISA试剂盒(CUSABIO CSB-E04741m，武汉华美)。

二、实验方法

1. 建立输卵管炎模型：48只6～8周龄BALB/c雌性小鼠，随机平均分为空白组和模型组。空白组：不处理；模型组：每只小鼠用1.5%的戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔麻醉后，再用0.1%新洁尔灭消毒外阴、0.9%的生理盐水清洗，将l×109/ml金黄色葡萄球菌悬液50 μl注入子宫底[4]。分别在接种3 d、7 d、14 d、28 d处死各模型组和对应时间点的空白组小鼠，各时间点每组均处死6只。

2. 病理学观察：迅速精确地切取输卵管组织，置于福尔马林溶液中固定，常规切片、HE染色，光镜下观察病理改变。

3. TNF-α检测：心脏采血，2 000 rpm离心20 min后取上清，采用ELISA双抗体夹心法，按照试剂盒说明书进行操作；用直线回归分析，画出标准曲线，计算各样品含量(pg/ml)。

4.实时荧光定量PCR检测TLR2 mRNA表达：RNA提取试剂盒提取输卵管总RNA，将mRNA逆转录成cDNA分子，在荧光定量PCR仪行PCR反应。

引物：TLR2 (Forward)：5’-AGCAGGATTCCCATTGGGTG-3’，(Reverse)：5’-CATTTGCCCGGAACGAAGTC-3’；β-actin (Forward)：5’-ATGTGGATCAGCAAGCAGGA-3’，(Reverse)：5’-AAGGGTGTAAAACGCAGCTC-3’。

每个标本3个复孔，取平均Ct值，结果2-ΔCt表示TLR2 mRNA相对于内参β-actin的表达量，2-ΔCt值越大，表示基因的表达量越大，其中ΔCt目标基因=Ct目标基因- Ctβ-actin。

三、统计学处理

应用SPSS 18.0 windows软件包分析，结果用±s表示。非正态分别数据组间比较采用Mann-Whitney U test，绘图采用Origin 7.0 进行，计算统计资料采用Pearson χ2检验；检验水准α=0.05，双侧。

结果

一、小鼠输卵管光镜下的病理学改变

正常输卵管壁由粘膜、肌层、浆膜三层构成。粘膜层主要由单层纤毛柱状上皮细胞组成。管壁组织结构清晰，粘膜层可见排列整齐的上皮柱状细胞，纤毛丰富，管腔通畅(图1A)。模型组输卵管三层结构中以粘膜层病变最为显著，早期(3 d)病变主要侵犯粘膜上皮，且局限于粘膜层，可见粘膜皱襞增粗且互相粘连，大量单核巨噬细胞浸润，少量纤毛脱落(图1B)；中期(7 d、14 d)粘膜柱状上皮细胞逐渐减少且成矮柱状、顶部纤毛显著变短，进而大部分脱落、间质空化，粘膜皱壁变平、减少，管腔扩大，浆膜层毛细胞血管扩张，可见淋巴细胞浸润(图1C、1D)；晚期(28 d)柱状上皮细胞呈卵圆形，可见裸露的细胞核，纤毛完全脱落，粘膜皱襞基本消失，坏死组织溶解吸收，管腔极度增大(图1E)。

二、模型组各时间点与相应空白组血清TNF-α水平变化

模型组血清TNF-α水平随着建模时间的延长而逐渐增加，到28 d时下降(3 d：1 817.926 pg/ml；7 d：2 227.699 pg/ml；14 d：2 378.322 pg/ml；28 d：1 791.388 pg/ml)，但各时间点TNF-α水平无显著性差异(P>0.05)；空白组各时间点之间TNF-α浓度无明显变化(3 d：496.788 pg/mL；7 d：505.175 pg/ml；14 d：498.652 pg/ml；28 d：512.134 pg/ml)(P>0.05)；各时间点TNF-α水平在模型组与空白组之间均有显著差异(P<0.05)(图2)。

A：空白组；B：造模3 d；C：造模7 d；D：造模14 d；E：造模28 d；L示管腔图1　空白组和模型组小鼠输卵管的病理学改变(HE染色 ×40)

图2　血清TNF-α水平在模型组和空白组的时间变化趋势

三、模型组各时间点与相应空白组输卵管组织TLR2 mRNA的表达变化

实时荧光定量PCR检测TLR2 mRNA的变化，以相对于正常组(%)表示。模型组与空白组在各时间点的TLR2 mRNA的表达(3 d：1.296 vs. 1.007；7 d：1.041 vs. 1.027；14 d：0.948 vs.1.022；28 d：0.822 vs.1.002)均无显著差异(P>0.05)。模型组TLR2 mRNA的表达量随着建模天数的增加逐渐降低，28 d时TLR2 mRNA的表达显著低于3 d时(P<0.05)(图3)。

*表示两组相比，P<0.05图3　空白组和模型组各时间点输卵管TLR2 mRNA的表达

讨论

TLRs是多种病原体感染的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，在免疫效应细胞包括单核细胞/巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞等均有表达，通过识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，触发相应的信号转导，进而促进巨噬细胞、粒细胞等炎性细胞聚集，最终引发固有免疫反应[5]。TLR2在单核细胞、中性粒细胞大量表达[6-7]，主要识别PAMPs革兰阳性菌[8]。TLR2通过髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)通路进行信号转导。在MyD88依赖信号途径中，MyD88被募集到活化的TLR2后，通过一系列转导级联，最终启动核因子κB(NF-κB)转位至细胞核，诱导炎症前细胞因子(主要是TNF-α等)的表达引起炎症反应，激活适应性免疫系统[9]。TNF-α是反应炎症程度的重要指标，主要由巨噬细胞和单核细胞产生，在正常输卵管以及炎性输卵管粘膜上皮细胞上均有表达[10]。TNF-α与输卵管炎的关系密切，研究证实TNF-α产生越多，输卵管损伤越严重，可能是由于高于生理水平的TNF-α可诱导机体产生一些有害物质，激活单核细胞、巨噬细胞，合成更多的白细胞介素 (IL)-1、6、8和TNF-α[11]，促进了炎症反应，加重输卵管损伤。

TLR2是引起先天免疫反应的重要媒介，在小鼠输卵管早期产生炎性介质和慢性炎症的病理发展中起着重要作用[12]。本实验模型组造模3 d时TLR2 mRNA表达升高，可能与TLR2识别病原菌启动免疫防御反应有关，随着接种金葡萄菌时间的延长，模型组随着造模时间的延长TLR2 mRNA表达逐渐降低，28 d时显著低于3 d时(P<0.05)，虽然与相应空白组均无显著性差异，但模型组各时间点病理改变却逐渐加重，推测异于生理水平的TLR2表达就能触发一系列级联转导，从而引起输卵管炎症反应。TLR2有分泌炎症因子的作用，并能较强的终止炎症反应[13]，在急性炎症反应初期，TLR2高表达募集炎症因子，激活炎症反应，待病原体消除后，则启动炎症反应终止机制，减少对组织损伤的破坏。本实验发现模型组接种金葡菌第28 d输卵管腔内炎症渗出物和坏死组织被溶解吸收，推测可能是TLR2启动了炎症反应终止机制，减轻了输卵管的炎症病变。

武孟香等[14]采用免疫组化法发现TNF-α在正常输卵管和炎症输卵管上均有表达，但正常输卵管粘膜上皮细胞的表达较低，炎症输卵管粘膜上皮细胞的表达显著高于正常输卵管组织。我们的研究也显示模型组各时间点血中TNF-α浓度显著高于相应空白组(P<0.05)，说明TNF-α在输卵管炎的发生中具有重要作用。TNF-α是介导输卵管上皮细胞凋亡的主要因子[15]。Nagarajan等[16]发现敲除了TLR2信号主要接头分子MyD88基因的小鼠，TNF-α产生减少，机体清除生殖道病原体的能力降低，最终导致输卵管慢性病变。本实验模型组小鼠感染金黄色葡萄球菌3 d、7 d、14 d后输卵管黏膜柱状上皮细胞变性、坏死，粘膜皱襞逐渐变平、减少，输卵管炎症从急性逐渐转为慢性，TNF-α浓度逐渐增高，感染28 d发现大量坏死的上皮细胞被巨噬细胞吞噬后凋亡、吸收、分解，TNF-α浓度降低。我们推测：空白组血液中TNF-α的低表达可能具有保护输卵管粘膜上皮细胞免受病原体入侵的作用，TNF-α在慢性炎症时产生增多，使免疫机制发生紊乱，从而导致输卵管粘膜的破坏。

综上所述，金黄色葡萄球菌大量入侵输卵管粘膜，TLR2识别病原菌，通过一系列信号转导，使单核巨噬细胞产生大量的TNF-α等促炎细胞因子，高于生理水平的TNF-α诱导机体产生一些有害物质，产生更多的TNF-α，通过其细胞毒作用及促炎因子间的协同作用，导致输卵管粘膜上皮细胞发生变性、坏死等一系列炎症反应，最终坏死物质被溶解吸收，TLR2启动炎症反应终止机制，减轻了输卵管的炎症病变。

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[编辑：辛玲]

Study on the relationship between expression of TLR2 & TNF-α and salpingitis

CHENXiao1，2*，WANGFeng-wei3

1.ReproductiveCenter，JinhuaPeople’sHospital，Jinhua321000

2.WuyiTraditionalChineseMedicineHospital，Jinhua321200

3.CentralLaboratory，Women’sHospital，SchoolofMedicine，ZheJiangUniversity，Hangzhou310012

【Abstract】

Objective： To establish a salpingitis model for exploring the association between toll like receptor-2 (TLR2) & tumor necrosis factor-α (TNF-α) and salpingitis.

Methods： Forty-eight BALB/c female mice of 6-8 weeks were randomly divided to control group and model group. The mice in control group had no treatment，and the fundus of uterus of mice in model group was injected 50 μl l×109/ml suspension of staphylococcus aureus. The blood and fallopian tubes were collected after 3，7，14，28 days of treatment. The expressions of TLR2 mRNA in fallopian tubes and serum TNF-α levels were detected by using real-time fluorescence quantitative PCR and ELISA，respectively，and the pathological changes of fallopian tubes were observed in the model group and control group.

Results： The expressions of TLR2 mRNA and serum TNF-α levels were not significantly different along with the time in the control group (P>0.05). The expressions of TLR2 mRNA were gradually decreased，while the concentrations of TNF-α were gradually increased after 3，7，14 days of treatment，but there were no significant differences (P>0.05). The TLR2 mRNA expression after 28 days of treatment was significantly lower than that after 3 days of treatment (P<0.05). The serum TNF-α levels in model group were all significantly higher than those in control group at corresponding time points (P<0.05).

Conclusions： TLR2 might induce more TNF-α production through a series of signal pathways to cause salpingitis.

Key words：TLR2；TNF-α；Salpingitis

【作者简介】陈晓，女，浙江金华人，硕士，主治医师，生殖医学专业.(*通讯作者，Email：30395478@qq.com)

【基金项目】金华市科技计划项目(No. 2014A33503)

【收稿日期】2015-05-30；【修回日期】2015-06-27

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.1.011