β-榄香烯对人食管癌细胞EC9706增殖、凋亡及caspase-3的影响

任凌燕　徐　磊　赵　青　罗　皓　赵　怡

作者单位:210000 解放军第四五四医院



β-榄香烯对人食管癌细胞EC9706增殖、凋亡及caspase-3的影响

任凌燕徐磊赵青罗皓赵怡

作者单位:210000 解放军第四五四医院

【摘要】目的研究β-榄香烯对人食管癌细胞EC9706增殖、凋亡及caspase-3表达的影响。方法采用不同浓度的β-榄香烯(0、10、20、30、40、50 μg/ml)处理细胞24 h，CCK-8测定细胞增殖活力。以50 μg/ml β-榄香烯处理细胞0、6、12、24 h，CCK-8测定细胞增殖活力。以不加β-榄香烯组作为对照组，选取50 μg/ml β-榄香烯处理细胞24 h，流式细胞术测定细胞凋亡率，分光光度法测定 caspase-3活性。结果随着β-榄香烯浓度的增加，人食管癌细胞增殖活力逐渐下降，呈浓度依赖性(P<0.05)。以50 μg/ml β-榄香烯处理细胞 0、6、12、24 h，随着时间的增加，细胞增殖活力下降，呈现时间依赖性(P<0.05)。相比对照组，50 μg/ml β-榄香烯处理细胞24 h后细胞凋亡明显增加(P<0.05)，caspase-3活性明显增加(P<0.05)。结论β-榄香烯可抑制食管癌细胞增殖、诱导其凋亡，并且其诱导凋亡的作用机制可能与促进caspase-3活化有关。

【关键词】β-榄香烯；人食管癌细胞；增殖；凋亡

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:202～204)

食管癌为我国常见恶性肿瘤之一，在我国全部恶性肿瘤中，其发病率和死亡率分别占第4位和第2位[1]。β-榄香烯是从中药莪术中提取出来的二类抗癌新药，具有抗癌活性。也有较多研究[2-3]表明榄香烯对诸多肿瘤有抗癌效应。本实验采用β-榄香烯对食管癌细胞的干预，观察其对细胞增殖、凋亡及caspase-3活性的影响。

1材料与方法

1.1　材料

食管癌细胞株(EC9706)购自上海北诺生物科技有限公司，β-榄香烯购自大连金港制药有限公司；完全培养基采用DMEM培养基、10%胎牛血清、青霉素100 U/L、链霉素100 U/L(美国Gibco)；CCK-8试剂盒(东京同仁化学)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基)；caspase-3分光光度法测试剂盒(南京凯基)。

1.2　方法

1.2.1细胞培养将食管癌细胞置于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中培养，培养条件：37 ℃、5% CO2及饱和湿度。贴壁生长至融合状态，用0.25%胰蛋白酶0.53 mmol/L EDTA 消化，选择生长状态良好的细胞进行传代。将细胞以 104个/ml接种在6孔板，细胞贴壁融合达70～80%时，更换为无血清DMEM培养液同步化24 h。每次实验均采用同一代细胞，不同批次细胞重复实验3次。

1.2.2不同浓度β-榄香烯处理细胞24 h后细胞增殖活力测定将细胞随机分组：分别用含0、10、20、30、40、50 μg/ml的β-榄香烯加入培养基中，处理细胞24 h，96孔板中每孔加入CCK-8 20 μl,继续在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下孵育4 h，采用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的OD值，测定细胞增殖活力。

1.2.350 μg/ml的β-榄香烯处理细胞0、6、12、24 h后细胞增殖活力测定将细胞随机分组：分别用含50 μg/ml的β-榄香烯加入培养基中，处理细胞0、6、12、24 h，96孔板中每孔加入CCK-8 20 μl,继续在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下孵育4 h，酶标仪450 nm波长处测定各孔的OD值，测定细胞增殖活力。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡以不含β-榄香烯的培养基处理组作为对照组。选取50 μg/ml的β-榄香烯加入培养基中，处理细胞24 h，0.25%胰酶(无EDTA)消化并收集细胞，PBS洗涤，Annexin Ⅴ/PI 染色后流式细胞术检测细胞凋亡。

1.2.5caspase-3活化程度的检测细胞分组同1.2.4，干预 24 h，冰上裂解细胞,吸取50 μl含100～200 μg蛋白的细胞裂解液，加入Reaction Buffer、caspase-3 Substrate，避光孵育4 h。酶标仪波长400 nm测定各组吸光值(OD值)，通过各组OD值/健康人血清组OD值的倍数来确定各组caspase-3活化程度。

1.3　统计学分析

2结果

2.1　不同浓度β-榄香烯处理细胞24 h后对细胞增殖

活力的影响

与0 μg/ml组OD值(2.34±0.46)比较，10、20、30、40、50 μg/ml组细胞增殖活力下降(OD值分别2.16±0.37、1.76±0.54、1.57±0.29、1.28±0.35、0.80±0.19)，并呈现浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

a为与0 μg/ml组比较，P<0.01;b为与50 μg/ml组比较，P<0.01。

2.2　50 μg/ml β-榄香烯处理细胞0、6、12、24 h后对细胞增殖活力的影响

和0 h组OD值(2.46±0.18)比较,6、12、24 h组细胞增殖活力下降(OD值分别为1.48±0.46、1.27±0.35、0.74±0.24)，并呈现时间依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

a为与0 μg/ml组比较，P<0.01。

2.3　50 μg/ml β-榄香烯处理细胞24 h时对细胞凋亡的影响

与对照组(0 μg/ml β-榄香烯)凋亡率[(1.21±0.59)%]比较，50 μg/ml β-榄香烯处理细胞24 h，可诱导细胞凋亡[凋亡率(16.21±0.32)%]，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3　0、50 μg/ml β-榄香烯处理细胞24 h，对细胞凋亡的影响

2.4　50 μg/ml β-榄香烯处理细胞24 h时对 caspase-3活性的影响

与对照组(0 μg/ml β-榄香烯)相比，50 μg/ml β-榄香烯处理细胞24 h可明显增加caspase-3活性，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4　0、50 μg/ml β-榄香烯处理细胞24 h，对细胞

3讨论

榄香烯(1-甲基-1-乙烯基-2,4-异丙烯基-环己烷)提取自姜科植物莪术，这是一种新型的抗癌药。榄香烯提取物是一种混合物，含有β-、δ-和γ-榄香烯，其中β-榄香烯是主要成分，在3种亚型中占60%～72%。在我国，榄香烯已经在治疗白血病以及脑部、乳腺、胸部、肝脏和其他组织的癌症中显示出疗效[4]。作为一种抗癌药，β-榄香烯的主要优势包括：对于许多类型的癌症具有广谱抗癌效果，包括耐药肿瘤，它不会导致多重药物耐药性，而且能够逆转对其他药物产生的耐药性并且毒性低。

已有大量实验研究证实该药对多种癌细胞有显著的抑杀作用，能够诱导肿瘤细胞凋亡和分化，通过癌细胞S、G2、M 期调控点，阻滞S期细胞进入G2、M 期。该药不同于传统的化疗药物之处：其无骨髓毒性，亦可提高机体免疫功能，升高白细胞数量，属非细胞毒抗肿瘤药[5]。与化疗药物联合使用具有增敏减毒、提高患者生活质量以及不良反应轻微等显著特点[6]。本研究显示，β-榄香烯可以抑制食管癌细胞的增殖，并且其抑制作用与剂量、作用时间相关，呈现浓度依赖性和时间依赖性。

细胞凋亡异常是多种疾病产生的发病机制，通常见于肿瘤、自身免疫疾病、神经系统疾病和心血管系统疾病等。肿瘤是一种细胞增殖和死亡均发生了异常的疾病，细胞凋亡不仅在肿瘤发生和发展中有重要意义,而且化疗、放疗和生物治疗的原理就是通过诱导细胞凋亡来治疗肿瘤的[7]。本研究结果提示：相比正常对照组，β-榄香烯可诱导食管癌细胞凋亡。

caspase蛋白酶家族属于天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶,在机体细胞获得凋亡信号后,caspase通过结合特异的辅因子而被激活,后经一系列的切割,效应caspase最终被激活,将其它酶蛋白作为级联切割底物并引发细胞凋亡[8]。caspase-3是参与细胞凋亡的重要机制，可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡[8]，它的活化是凋亡进入不可逆阶段标志[9]。caspase-3的表达不但反映了细胞凋亡水平，而且证明了凋亡启动因素的存在。本研究结果提示，β-榄香烯可促进食管癌细胞caspase-3活化，这也可能是β-榄香烯诱导食管癌细胞凋亡的机制。

总之，本研究表明,β-榄香烯可抑制食管癌细胞增殖、诱导食管癌细胞凋亡，并且其诱导凋亡的机制可能与其促进caspase-3活化有关。

参考文献

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[2]左云飞，张耀铮，魏巍，等.榄香烯诱导肝癌腹水瘤细胞系HcaF53/CL-16A3 凋亡的实验研究〔J〕.中药药理与临床,1998,14(2):20-22.

[3]邹丽娟，刘伟先，于丽敏，等.β-榄香烯诱导K562白血病细胞凋亡〔J〕.中华肿瘤杂志,2001,23(3):196-198.

[4]Guan C,Liu W,Yue Y，et al.Inhibitory effect of β-elemene on human breast cancer cells〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2014,7(7):3948-3956.

[5]Li LJ，Zhong LF，Jiang LP，et al.β-Elemene radiosensitizes lung cancer A549 cells by enhancing DNA damage and inhibiting DNA repair〔J〕.Phytother Res,2011,25(7):1095-1097.

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[7]Nicholson DW,Thornberry NA.Apoptosis:Life and death decisions〔J〕.Science,2003,299(5604):214-215.

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[9]Zhang Y,Goodyer C，LeBlanc A.Selective and protracted apoptosis in human primary neurons microinjected with active caspase-3,-6,-7,and-8〔J〕.J Neurosci,2000,20(22):8384-8389.

(编辑：甘艳)

Effect of β-elemene on Proliferation，Apoptosis and Activity of Caspase-3 of the Human Esophageal Carcinoma Cell EC9706

RENLingyan，XULei,ZHAOQing,etal.No.454HospitalofPLA,Nanjing,210000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of β-elemene on the proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma cell EC9706,and to explore the possible mechanisms of apoptosis induced by β-elemene.MethodsHuman esophageal carcinoma cell EC9706 were incubated in vitro.Cells were treated with different concentrations of β-elemene (0、10、20、30、40、50 μg/ml)for 24 h or treated with 50 μg/ml β-elemene for 0,6,12 and 24 h,and the proliferation of EC9706 cells was evaluated by CCK-8.EC9706 cells were treated with 50 μg/ml β-elemene for 24 h.The apoptosis were tested by flow cytometry and the activity of caspase-3 was measured by spectrophotometry.ResultsThe proliferation of EC9706 cells was inhibited in the β-elemene in a certain range of concerntration(0~50 μg/ml).With the increase of β-elemene concerntration,the proliferation of EC9706 cells was inhibited in a concerntration-dependent manner (P<0.05) .Compared with EC9706 cells treated in 0 hours,the proliferation of EC9706 cells was significantly decreased in 6，12 and 24 hours(P<0.05).The apoptosis rate was greater when EC9706 cells were incubated in 50 μg/ml β-elemene for 24 h than that in 0 μg/ml β-elemene (P<0.05).At the meantime,the activity of caspase-3 in EC9706 cells was upregulated by β-elemene.ConclusionThe proliferation of EC9706 cells is inhibited by β-elemene in the concerntration-dependent and time-dependent manner.β-elemene induced apoptosis of EC9706 cells,which might be due to the activation of caspase-3.

【Key words】β-elemene;Human esophageal carcinoma cell;Proliferation;Apoptosis

(收稿日期2015-03-18修回日期 2015-09-22)

中图分类号：R735.1

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)02-0202-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.008

通讯作者：赵怡