胃癌腹膜转移相关基因MYH-9与胃癌转移及其预后的关系

朱　捷　丁　皓　王校红

作者单位：200041 上海市复旦大学附属华山医院



胃癌腹膜转移相关基因MYH-9与胃癌转移及其预后的关系

朱捷丁皓王校红

作者单位：200041 上海市复旦大学附属华山医院

【摘要】目的研究胃癌腹膜转移相关基因MYH-9与胃癌转移及预后的关系。方法50例组织标本取自手术切除的胃癌组织及同一患者的腹膜转移组织标本。组织固定在10%的缓冲甲醛溶液用于病理诊断，冷冻于液氮中备于免疫印迹分析、细胞培养、siRNA转染、细胞粘附实验。结果MYH-9在所有的鳞状细胞癌组织(100%)和8个邻近正常组织中表达(26.7%，P=0.000)。癌组织中MYH-9高表达水平与腹膜转移、肿瘤分化程度差和较晚的肿瘤分期显著相关。单变量分析结果显示:肿瘤分期、胃癌病灶是否切除、腹膜转移的存在、MYH9高表达(基于免疫组化染色)与患者总生存率显著相关(P=0.008、P=0.001、P=0.006和P=0.007)。进一步的多因素回归分析显示，肿瘤分期与MYH-9高表达是与总生存期相关的独立不良预后因素。结论MYH-9的过度表达可能与较高的癌细胞迁移性相关。

【关键词】胃癌；腹膜转移；MYH-9；预后

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:195～197)

目前有关MYH-9基因在胃癌中的表达、作用及其机制的报道很少。因此本文重点研究胃癌腹膜转移相关基因MYH-2在胃癌转移及预后中的关系，现报告如下。

1材料与方法

1.1　一般资料

组织标本取自2011年4月至2014年9月于本院手术切除或探查的胃腺癌组织及同一患者的腹膜转移组织标本，共50例。男性33例、女性17例，其中行胃癌病灶切除者41例、未切除者9例。所有患者在手术前均未接受放疗或围术期化疗。临床病理分期是根据国际联盟描述防癌病理肿瘤节点转移(PTNM)的标准确定分类(2009)，2例为ⅠB期，15例为ⅡA期，5例为ⅡB期，14例为ⅢA期，8例为ⅢB期，6例为Ⅳ期。组织固定在10%的缓冲甲醛溶液用于病理诊断，冷冻于液氮中备于免疫印迹分析。随访所有患者，总体生存时间记录为手术至死亡或最后一次随访时间。本研究获得患者知情同意书及医学伦理委员会批准。

1.2　免疫组化法

厚4 μm的组织切片由福尔马林液固定，石蜡包埋手术标本并置于载玻片上。脱蜡和水合后，用封闭缓冲液(3%H2O2)破坏内源性过氧化物酶，并在压力消毒器中进行抗原修复。2%正常山羊血清浸润玻片，室温下10 min后，加入抗肌球蛋白ⅡA的小鼠单克隆抗体(1∶500稀释)，并在37 ℃下维持1 h。第二和第三广谱抗体随后加入。载玻片与3-氨基-9- 乙基咔唑(AEC)底物溶液(AEC-0037，迈新生物，福州，中国)在37 ℃的水浴中20 min。洗涤后，将载玻片用苏木精染色。阴性对照用磷酸缓冲盐水(PBS)处理，而不是肌球蛋白ⅡA抗体。

1.3　siRNA转染

MYH9的SiRNA(HS-MYH9-1，目录号SI00038346，和HS-MYH9-6，目录号SI02654911)，阳性对照siRNA(HS-MAPK1/3，目录号SI03650367)，和阴性对照siRNA(按Ctrl - AllStars中-1，目录号SI03650318)购自Qiagen公司(瓦伦西亚，CA，美国)。细胞的siRNA的转染根据HiPerFect转染试剂(Qiagen公司)的指导进行。简言之，将阳性对照siRNA(MAPK1/3)转染入KYSE-510细胞，以优化HiPerFect转染试剂与siRNA的比率，并获得最佳的沉默效应。转染2个MYH9 siRNA，找到有效的siRNA。

1.4　免疫印迹分析

完全除去生长培养基收集细胞，并加入细胞裂解缓冲液(含有蛋白酶抑制剂混合物1∶100)进行裂解。细胞裂解物用橡皮刮收集。肿瘤和邻近的正常组织冷冻在液氮中，并用粉末状的研钵和杵和通过细胞裂解缓冲液裂解。样品转移至微量离心管，均质化，4℃下以14 000 r/min，15 min微量离心沉淀蛋白。将样品溶于十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液然后煮沸。SDS样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳解析，并转移到聚偏二氟乙烯膜。拍摄免疫印迹蛋白。

1.5　统计学方法

应用SPSS 15.0统计软件进行统计处理。计数资料采用t检验，而分类变量采用χ2检验。Kaplan-Meier法评估生存曲线，对数秩检验曲线之间的差异。Cox回归分析评估临床病理因素和肌球蛋白ⅡA表达的预后价值。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1　MYH9表达与淋巴结转移和肿瘤分期的相关性

MYH9表达于所有癌组织细胞质和部分癌症组织的细胞膜上。一些正常胃上皮细胞也呈低水平表达。在癌组织中MYH9阳性表达率明显高于癌旁正常组织(100.0%和26.7%，χ2=50.575，P=0.000)。除了免疫组织化学分析，28个肿瘤样品和它们的配对正常邻近组织，通过免疫印迹分析定量测定MYH9的表达水平。免疫组化检测结果一样，免疫印迹分析检测到28个肿瘤中均有MYH9的表达。免疫组化检测肿瘤患者50例，其中25例(50%)有较强的MYH9免疫反应。患者临床病理特征与鳞状细胞癌和MYH9表达之间的相关性见表1。分析表明，MYH9表达水平与肿瘤腹膜转移(P=0.015<0.05)，肿瘤分化较差(P=0.018<0.05)，以及肿瘤分期较晚(ⅢB期和Ⅳ期，P=0.007<0.01)相关。

表1　MYH9表达与胃癌临床病理特征的相关性(例，%)

2.2　MYH9表达与患者生存率的关系

单因素和多因素分析50例患者的整体生存信息。平均随访时间为19.5个月(4～34个月)。单变量分析结果显示：肿瘤分期、胃癌病灶是否切除、腹膜转移的存在、MYH9高表达(基于免疫组化染色)与患者总生存率显著相关(P=0.008、P=0.001、P=0.006和P=0.007)，见表2。

表2　单因素Cox回归分析总生存期

对MYH9高表达、腹膜转移、肿瘤分期、胃癌病灶是否切除进行多变量分析，Cox多因素回归分析结果显示：肿瘤分期和MYH9高表达是总生存期(P=0.012和P=0.018)显著相关的独立不良预后因素,见表3。

表3　多因素Cox回归分析总生存期

3讨论

在这项研究中，观察到胃腺癌癌鳞状细胞癌组织中，MYH9的表达增高。MYH9的高表达与腹膜转移，较差的癌症分化，晚期肿瘤阶段及不良预后相关。在鳞癌细胞中，肌球蛋白ⅡA由MYH9的siRNA编码，其能够增加细胞基质粘附和细胞迁移[1]。这些结果表明，MYH9的高表达可能是胃癌鳞状细胞癌临床预后差的预测指标。细胞迁移涉及细胞突，极化，附着到细胞外基质，粘附以及细胞尾缩回。肌球蛋白ⅡA据参与这一系列的步骤。MYH9基因编码的肌球蛋白ⅡA族分子组装成肌球蛋白纤丝整个细胞，并最终形成的蜂窝结构，诸如应力纤维与肌动蛋白丝连接[2]。肌球蛋白ⅡA依赖性收缩力细胞体向前运动，同时解离附着在细胞后部尾巴(肌球蛋白ⅡA依赖性)，完成细胞收缩和向前运动。在此过程中，牵引力的约60%是由肌球蛋白ⅡA生成的[3]。肌球蛋白ⅡA在细胞突起粘着复合物的成熟过程中必不可少。在目前的研究中，肌球蛋白ⅡA siRNA介导抑制癌细胞的迁移；这一发现与已发表的研究一致。因为细胞迁移的速度取决于与细胞外基质的相互作用，我们研究抑制肌球蛋白ⅡA族是否影响细胞-基质粘附性[4]。结果表明，MYH9 siRNA-介导的肌球蛋白ⅡA显著增加细胞粘附到基质。这一发现与巴宾等的观察人结肠上皮细胞结果是一致的[5]。本文研究胃癌腹膜转移相关基因MYH-2在胃癌转移及预后中的关系时，首先讨论MYH9表达与淋巴结转移和肿瘤分期相关性。MYH9表达于所有癌症组织细胞质和某些癌症组织中的细胞膜上。一些正常食管上皮细胞也表现出低水平的表达。在癌组织中的阳性MYH9的表达率明显高于癌旁正常组织。除了免疫组织化学分析，28个肿瘤样品和它们的配对正常邻近组织，通过免疫印迹分析定量测定MYH9的表达水平。免疫组化检测结果一样，免疫印迹分析检测到28个肿瘤中均有MYH9的表达[6]。免疫组化检测的肿瘤50例，其中25例(50%)有较强的MYH9免疫反应。患者临床病理特征与鳞状细胞癌和MYH9表达之间的相关性分析表明，MYH9表达水平与腹膜转移、分化较差以及晚期肿瘤分期相关。此外，单因素和多因素分析50名患者的整体生存信息。平均随访时间为19.5个月(4～34个月)。单变量分析，肿瘤分期、胃癌病灶是否切除、腹膜转移的存在、MYH9高表达与总生存期有显著的关联。肿瘤分期、胃癌病灶是否切除、腹膜转移的存在、MYH9高表达均进行多变量分析，以确定预后不良因素。Cox多因素回归分析，肿瘤分期和MYH9高表达是总生存期显著相关的独立不良预后因素。本文免疫组化的数据发现球MYH9的表达水平在低分化组最高。这可以通过肌球蛋白ⅡA的细胞分裂来解释[7]。然而，在本研究中，发现MYH9的表达与肿瘤浸润深度之间没有关系,这不同于巴宾等报道[8]。

总之，MYH9的高表达与胃癌鳞状细胞癌、腹膜转移，癌症晚期阶段，降低总体生存显著相关。

参考文献

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(编辑：吴小红)

Relationship between Peritoneal Metastasis-Related Gene MYH-9 and Metastasis and Prognosis of Gastric Cancer

ZHUJie,DINGHao,WANGXiaohong.HuashanHospitalAffiliatedtoFudanUniversityofShanghai,Shanghai,200041

【Abstract】ObjectiveTo study the relationship between peritoneal metastasis-related gene MYH-9 and metastasis and prognosis of gastric cancer.Methods50 cases of tissue samples were obtained from gastric tissue after surgical resection and retroperitoneal metastasis tissue of the same patient.Tissues were fixed in 10% buffered formalin solution for pathological diagnosis,frozen in liquid nitrogen prepared in immunoblot analysis,cell culture,siRNA transfection,cell adhesion experiments.ResultsThe expression of MYH-9 (26.7%,P=0.000) in all of squamous cell carcinoma (100%) and 8 adjacent normal tissues.In the cancer tissues,MYH-9 expression levels increased significantly with lymph node metastasis,differentiation and malignant cancer,as well as associated with advanced tumor stage.Single factor analysis showed that tumor stage,lesion resection,peritoneal metastasis,and MYH-9 high expression (based on immunohistochemical staining) were significantly associated with overall survival (P=0.008,P=0.001,P=0.006 andP=0.007).Further multivariate regression analysis showed that tumor stage and MYH-9 high expression were associated with the overall survival of the independent adverse prognostic factors.ConclusionOverexpression of MYH-9 may related with cancer cell migration.

【Key words】Gastric cancer;Peritoneal metastasis;MYH-9;Prognosis

(收稿日期2015-03-24修回日期 2015-09-14)

中图分类号：R735.2

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)02-0195-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.006