胃癌组织核转录因子κB p65蛋白表达与肿瘤多药耐药性的关系

李 勇，耿建磊，檀碧波，范立侨，赵 群，刘 羽，刘庆伟



胃癌组织核转录因子κB p65蛋白表达与肿瘤多药耐药性的关系

李 勇，耿建磊，檀碧波，范立侨，赵 群，刘 羽，刘庆伟

【摘要】目的分析胃癌组织中核转录因子κB(NF-κB)p65蛋白表达与肿瘤多药耐药性(MDR)的关系，并探讨其意义。方法选取2013年1—12月在河北医科大学第四医院外三科手术切除并经病理证实的68例胃癌患者的肿瘤组织及癌旁组织。采用免疫组化(SP)法检测胃癌组织及癌旁组织NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表达；采用体外药物敏感实验(MTT法)检测胃癌组织细胞对氟尿嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)、紫杉醇(PTX)、奥沙利铂(L-OHP)、表阿霉素(eADM)的体外化疗药物敏感性。结果胃癌组织NF-κB p65、P-gp、Bcl-2蛋白强表达率均高于癌旁组织，Bax蛋白强表达率低于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关分析结果显示，胃癌组织NF-κB p65与P-gp蛋白表达呈正相关(rs=0.321，P=0.008)，NF-κB p65与Bax蛋白表达呈负相关(rs=-0.333，P=0.006)，NF-κB p65与Bcl-2蛋白表达无直线相关关系(rs=0.231，P=0.058)。在胃癌组织中，5-FU、PTX对NF-κB p65强表达者肿瘤细胞抑制率低于弱表达者，差异有统计学意义(P<0.05)；5-FU、PTX、L-OHP对P-gp强表达者肿瘤细胞抑制率低于弱表达者，差异有统计学意义(P<0.05)；5-FU、PTX、eADM对Bcl-2强表达者肿瘤细胞抑制率低于弱表达者，差异有统计学意义(P<0.05)；5-FU、L-OHP、eADM对Bax强表达者肿瘤细胞抑制率高于弱表达者，差异有统计学意义(P<0.05)。结论胃癌组织中NF-κB p65表达增高，其可能通过调控P-gp、Bax蛋白表达而参与胃癌MDR。

化疗是胃癌综合治疗的重要措施之一，但目前常用的化疗方案效果均不能令人满意，主要是由于胃癌细胞存在较强的多药耐药性(multidrugs resistance，MDR)[1-2]。阐明胃癌MDR的机制并进行逆转可能提高化疗效果、改善预后。但迄今关于胃癌MDR的机制还不完全明确。核转录因子кB(NF-κB)是转录因子蛋白家族，作为信号通路，NF-κB可调控多个下游基因表达，NF-κB p65蛋白是其中的重要成员[3-5]。有关NF-κB p65蛋白在胃癌MDR中作用的报道还不多见。为了解NF-κB p65蛋白在胃癌组织中表达情况及与胃癌MDR的关系，本研究检测了NF-κB p65蛋白及胃癌MDR相关的P-糖蛋白(P-gp)、Bcl-2、Bax的表达情况，同时应用噻唑蓝(MTT)方法检测了肿瘤细胞的体外化疗敏感性，进一步对NF-κB p65蛋白与胃癌MDR因子和化疗敏感性的关系进行分析，为探讨NF-κB p65蛋白在胃癌MDR中发挥的作用提供了依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂兔抗人NF-κB p65单克隆抗体为美国Bioworld Technology公司产品，兔抗人P-gp、Bcl-2、Bax多克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，免疫组化试剂盒购自美国ZYMED公司。RPMI 1640培养基、MTT、胰蛋白酶为美国Gibico公司产品。氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)为上海旭东海普公司产品，长春新碱(Vincristine，VCR)、紫杉醇(Paclitaxel，PTX)、表阿霉素(Epidoxorubicin，eADM)为浙江海正药业公司产品，奥沙利铂(Oxaliplatin，L-OHP)为江苏恒瑞药业公司产品。

1.1.2标本来源及处理标本来源于2013年1—12月在河北医科大学第四医院外三科手术切除并经病理证实的68例胃癌患者的肿瘤组织。68例患者中男38例，女30例；年龄42～77岁，中位年龄65岁。排除复发胃癌、合并其他恶性肿瘤及术前应用过放化疗者。术中标本离体后取新鲜肿瘤组织1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm置入RPMI 1640培养液保存，在离体1 h内由专人进行研磨分散，准备用于化疗药物敏感实验。另取标本一份经4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片后用于免疫组化(SP)染色。同时取癌旁组织一份(1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm)，距肿瘤边缘≥3 cm，术后镜下证实无癌细胞，4%多聚甲醛溶液固定进行SP法染色。

1.2实验方法

1.2.1SP法检测NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表达采用SP法对肿瘤石蜡组织进行染色，严格按照试剂盒说明进行染色操作。用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。由2位病理专业人员分别阅片进行结果判断。切片随机取5个(×400)高倍视野，每视野计数100个细胞，NF-κB p65以细胞核着染呈棕黄色为染色阳性，P-gp、Bcl-2、Bax以细胞膜和/或细胞质着染呈棕黄色为染色阳性，按肿瘤细胞着色强度和阳性细胞率分别进行计分。着色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；肿瘤细胞阳性细胞率计分标准：阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分；两种计分标准所得分值的乘积为0或1分表示阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～7分为阳性(++)，≥8分为强阳性(+++)。表达强度标准：≤3分为弱表达，≥4分为强表达。

1.2.2体外药物敏感实验(MTT法)肿瘤组织经研磨分散，无菌条件下，用0.9%氯化钠溶液漂洗组织2次，剪碎，放入0.25%胰蛋白酶消化液。细胞消化液经200目细胞筛过滤，制成单细胞悬液。用已配置的RPMI 1640完全培养液配制成单个细胞悬液；经苔盼蓝染色计数活细胞，用完全培养液调整细胞浓度为5×105/ml接种于96孔板，100 μl/孔(含5×104个细胞)。使用前将肿瘤药敏检测板和DMEM培养基预温至37 ℃。将5种受试药物分别加入肿瘤细胞悬液中，分别为5-FU 10 μg/ml、VCR 0.5 μg/ml、PTX 10 μg/ml、L-OHP 20 μg/ml、eADM 0.4 μg/ml[6]。空白组加入磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照。接种细胞悬液200 μl/孔，微量振荡器振荡混匀，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h，加MTT(5 mg/ml)20 μl/孔，继续培养3～24 h，依据显微镜下观察MTT还原形成蓝色针状结晶终止培养。将细胞培养板以1 000 r/min离心10 min，弃上清液，吸水纸吸去残留液体。加入DMSO 100 μl/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪570 nm测各孔吸光度(A)值。肿瘤细胞平均抑制率(IR)=(1-给药孔平均A值)/对照孔平均A值×100%。

2结果

2.1胃癌组织NF-κB p65、P-gp、Bcl-2及Bax蛋白表达情况胃癌组织NF-κB p65、P-gp、Bcl-2蛋白强表达率均高于癌旁组织，Bax蛋白强表达率低于癌旁组织，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2胃癌组织NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表达的关系Spearman相关分析结果显示，胃癌组织NF-κB p65与P-gp蛋白表达呈正相关(rs=0.321，P=0.008)，NF-κB p65与Bax蛋白表达呈负相关(rs=-0.333，P=0.006)，Bcl-2与Bax蛋白表达呈负相关(rs=-0.401，P=0.001)，NF-κB p65与Bcl-2、P-gp与Bax蛋白表达无明显相关关系(rs=0.231，P=0.058；rs=-0.196，P=0.108)。

2.3胃癌组织NF-κB p65、P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表达与化疗药物敏感性的关系在胃癌组织中，5-FU、PTX对NF-κB p65强表达者肿瘤细胞抑制率低于弱表达者，差异有统计学意义(P<0.05)；5-FU、PTX、L-OHP对P-gp强表达者肿瘤细胞抑制率低于弱表达者，差异有统计学意义(P<0.05)；5-FU、PTX、eADM对Bcl-2强表达者肿瘤细胞抑制率低于弱表达者，差异有统计学意义(P<0.05)；5-FU、eADM、L-OHP对Bax强表达者肿瘤细胞抑制率高于弱表达者(P<0.05，见表2)。

3讨论

研究证明胃癌细胞对不同作用机制的化疗药物存在明显抵抗作用，称为MDR[7]。胃癌细胞的这种特性是导致化疗失败的直接原因，也是胃癌患者复发转移及死亡的重要因素。胃癌MDR是多种相关基因及信号通路相互调控、共同作用的结果[8]。胃癌MDR的作用机制复杂，但迄今尚未发现其中的关键调控分子，因而胃癌MDR逆转的研究也尚未取得突破性进展。NF-κB是具有广泛作用的真核细胞转录调节因子家族，参与细胞的多种生理病理过程。NF-κB p65蛋白是NF-κB家族中重要成员，研究发现NF-κB p65蛋白在多种恶性肿瘤中存在表达增高现象，并参与多种肿瘤的MDR[9-11]。本研究结果也显示，NF-κB p65蛋白在胃癌组织中表达高于癌旁组织，且5-FU、PTX对NF-κB p65蛋白强表达者肿瘤细胞的抑制率明显低于弱表达者，提示NF-κB p65蛋白可能参与了胃癌发生，并且NF-κB p65蛋白强表达时胃癌细胞对5-FU、PTX的敏感性降低，参与了胃癌MDR。但本研究也发现肿瘤细胞对VCR、L-OHP、eADM的敏感性与NF-κB p65蛋白表达无关，提示NF-κB p65蛋白可能仅参与了部分化疗药物的耐药调控，但具体情况还应扩大研究规模并进行实验予以证实。

为了解NF-κB p65蛋白参与胃癌MDR的可能机制，本研究进一步检测了胃癌MDR相关蛋白P-gp、Bcl-2、Bax的表达，分析了其与NF-κB p65蛋白的关系。P-gp是经典MDR的重要蛋白，与VCR、VP-16等植物化疗药的耐药有关。P-gp的主要功能是将进入肿瘤细胞的药物以主动转运(药泵)的方式排出细胞外，从而导致药物的效果降低[12]。本研究结果显示，P-gp在胃癌组织中表达高于癌旁组织，P-gp表达增高时胃癌细胞对5-FU、PTX、L-OHP的耐药性增强。与本课题组前期研究结果符合[1]。本研究结果亦显示，胃癌组织NF-κB p65蛋白与P-gp蛋白表达呈正相关，提示NF-κB p65可能通过促进P-gp表达而参与胃癌MDR。Bcl-2是细胞中线粒体途径的凋亡抑制基因，具有通过增强细胞的凋亡抵抗能力而导致肿瘤细胞耐药的作用[13]。而Bax则具有促进细胞凋亡的作用，可与Bcl-2结合成Bcl-2/Bax二聚体而发挥作用，Bcl-2与Bax的比值决定了细胞凋亡水平的改变[14]。本研究结果显示，胃癌组织较癌旁组织Bcl-2表达增高、Bax表达降低，提示胃癌细胞具有较强的凋亡抵抗能力，这是胃癌MDR的重要原因。本研究发现Bcl-2强表达与5-FU、PTX、eADM的耐药性有关，而Bax强表达则与5-FU、L-OHP、eADM的耐药性有关。进一步研究发现NF-κB p65蛋白与Bax蛋白表达呈负相关，提示NF-κB p65蛋白可能具有抑制Bax表达的作用，是其参与胃癌MDR的另一机制。

表1　胃癌组织与癌旁组织NF-κB p65、P-gp、Bcl-2及Bax蛋白表达比较〔n(%)〕

注：NF-κB p65=核转录因子кB p65，P-gp=P-糖蛋白

Table 2Comparison of inhibition rate of chemotherapy drugs between gastric cancer tissues with weak expression of NF-κB p65，P-gp，Bcl-2 and Bax and tissues with strong expression

蛋白表达例数化疗药物抑制率5-FU VCR PTX eADM L-OHP蛋白表达例数化疗药物抑制率5-FU VCR PTX eADM L-OHPNF-κBp65Bcl-2 弱表达3135.38±7.4331.83±9.9442.68±11.4626.84±7.3239.34±6.26 弱表达3236.75±10.2633.80±9.4145.07±11.2932.82±6.2537.63±7.36 强表达3731.27±8.7632.95±10.6835.62±9.8925.42±8.3737.38±7.21 强表达3631.64±9.7331.02±7.4638.16±8.2724.60±5.9135.62±5.38 t值2.063-0.4442.7270.7371.185 t值2.1071.3572.9015.5721.295 P值0.043 0.6580.0080.4640.240 P值0.0390.1790.005<0.0010.200P-gpBax 弱表达2834.68±6.1833.42±6.7343.24±10.2629.61±8.3640.63±8.32 弱表达5130.84±8.5431.44±7.3338.91±9.2324.18±6.1630.34±6.82 强表达4028.42±7.2230.43±9.2234.36±8.9326.82±7.0834.32±7.94 强表达1738.39±7.3233.16±6.5343.64±6.3832.21±8.8238.14±9.37 t值3.7291.4633.7951.4843.162 t值-3.263-0.860-1.958-4.156-3.705 P值<0.0010.148<0.0010.1430.002 P值0.0020.3930.054<0.001<0.001

注：5-FU=氟尿嘧啶，VCR=长春新碱，PTX=紫杉醇，eADM=表阿霉素，L-OHP=奥沙利铂

本研究发现NF-κB p65蛋白在胃癌组织中表达增高，可能通过调控P-gp、Bax表达而参与胃癌MDR。但本研究仅对数据进行了统计分析，所得结论多为推测而来。进一步研究中准备应用NF-κB通路阻断剂及基因干扰技术对胃癌细胞中NF-κB通路进行干预，对干预后肿瘤细胞MDR特性的改变及机制进行深入研究，以发现NF-κB参与肿瘤MDR的确切机制。

多药耐药性(MDR)

肿瘤MDR并非多重耐药。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药产生耐药性的同时，对其他结构不同、作用靶点相异的抗肿瘤药也产生交叉性耐药的现象。MDR包括原发性(先天性)耐药(natural MDR)和继发性耐药(acquired MDR)：原发性耐药是肿瘤细胞固有的对化疗药物不敏感，故首次使用化疗药物就产生耐药；继发性耐药指肿瘤初始对化疗药物敏感，但经过化疗药物作用后产生的MDR现象。

作者贡献：李勇进行试验设计与实施、资料收集整理、研究质量控制、撰写论文、成文并对文章负责；耿建磊、檀碧波、范立侨、赵群、刘羽、刘庆伟进行了资料收集、实验实施及结果分析、统计处理等工作。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：贾萌萌)

·用药分析·

【关键词】胃肿瘤；多药耐药相关蛋白质类；核转录因子κB

李勇，耿建磊，檀碧波，等.胃癌组织核转录因子κB p65蛋白表达与肿瘤多药耐药性的关系[J].中国全科医学，2016，19(2)：238-241.[www.chinagp.net]

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Relationship Between the Protein Expression of Nuclear Transcription Factors κB p65 and Multidrug Resistance in Gastric CancerLIYong，GENGJian-lei，TANBi-bo，etal.ThirdDepartmentofGeneralSurgery，theFourthAffiliatedHospital，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050011，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between the protein expression of gastric cancer tissue nuclear transcription factors κB(NF-κB)p65 and the multidrug resistance(MDR)of tumor and explore its significance.MethodsWe collected the tumor tissue and para-carcinoma tissue of 68 patients who were pathologically diagnosed with gastric carcinoma and underwent excision surgery in the Third Department of General Surgery of the Fourth Affiliated Hospital，Hebei Medical University from January 2013 to December 2013.Using immunohistochemical SP method，the protein expression levels of NF-κB p65，P-gp，Bcl-2 and Bax in the collected tissues were detected.Using MTT method，the sensitivity of gastric cancer cells towards 5-FU，VCR，PTX，L-OHP and eADM was measured.ResultsThe strong expression incidence of NF-κB p65，P-gp，Bcl-2 proteins in cancer tissues was higher than that in para-carcinoma tissues，while Bax protein in cancer tissues was lower than that in para-cancer tissues(P<0.05).Spearman correlation analysis showed that positive relationship was found between the expression levels of NF-κB p65 and P-gp(rs=0.321，P=0.008)；expression of NF-κB p65 and that of Bax had negative correlation(rs=-0.333，P=0.006)，and the expression of NF-κB p65 had no significant correlation with that of Bcl-2(rs=0.231，P=0.058).In gastric cancer tissues with strong expression of NF-κB p65，the inhibition rates of 5-FU and PTX for cancer cells were lower than those tissues with weak expression of NF-κB p65(P<0.05)；in tissues with strong expression of P-gp，the inhibition rates of 5-FU，PTX and L-OHP for cancer cells were lower than tissues with weak expression of P-gp(P<0.05)；inhibition rates of 5-FU，PTX，eADM to cancer cells were lower in tissues with strong expression of Bcl-2 than tissues with weak expression of Bcl-2(P<0.05)，whereas in tissues with strong expression of Bax，inhibition rates of 5-FU，L-OHP and eADM to cancer cells were higher than tissues with weak expression of Bax(P<0.05).ConclusionGastric cancer tissues have higher expression of NF-κB p65 which might be involved in MDR of gastric cancer by regulating P-gp and Bax proteins.

【Key words】Stomach neoplasms；Multidrug resistance-associated proteins；NF-κB

收稿日期：(2015-07-21；修回日期：2015-11-06)

【中图分类号】R 735.2

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.02.024

通信作者：李勇，050011河北省石家庄市，河北医科大学第四医院外三科；E-mail：liyonghbth@126.com

基金项目：作者单位：050011河北省石家庄市，河北医科大学第四医院外三科(李勇，檀碧波，范立侨，赵群，刘羽，刘庆伟)；河北省儿童医院普外科(耿建磊)