原料乳中玉米赤霉烯酮胶体金免疫试纸条检测方法的建立

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（1.东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室哈尔滨150030；2.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150028）

原料乳中玉米赤霉烯酮胶体金免疫试纸条检测方法的建立

丁木1，姜霞1，王蕊1，孙露宏1，周文琦1，赵玥明1，满朝新2，姜毓君1,2

（1.东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室哈尔滨150030；2.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150028）

采用柠檬酸三钠法合成胶体金，与抗玉米赤霉烯酮单抗（ZEA-mAb）制成抗体-胶体金标记物，包被于胶体金结合垫上。玉米赤霉烯酮半抗原和蛋白的偶联物（ZEA-BSA）和羊抗鼠IgG分别喷涂于硝酸纤维素膜作为检测线（T线）和质控线（C线），建立原料乳中玉米赤霉烯酮（ZEA）的胶体金免疫试纸条检测法。结果显示，试纸条的灵敏度为30n g/mL，与其他毒素无交叉反应，10 min内即可肉眼观察结果。检测添加有玉米赤霉烯酮的原料乳样品，该试纸条的检测限为50 ng/mL。方法可用于原料乳中玉米赤霉烯酮的快速检测。

玉米赤霉烯酮；试纸条；原料乳

0 引言

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)是由多种镰刀真菌产生，易导致不孕、流产[1]；此外，还具有细胞毒性、免疫毒性[2-3]，严重威胁人类健康。ZEA主要存在于作物中[4-5]，会严重影响以谷物为饲料的反刍动物生产，影响乳的品质。我国饲料卫生标准中规定玉米类饲料中ZEA质量分数不准超过500 μg/kg，GB 2761中规定谷物及其制品中ZEA不超过60 μg/kg。

目前用于测定ZEA的方法，如：薄层层析（thin-layer chromatography，TLC)、气相色谱法(gas chromatography，GC)[6-8]，通常需要大型设备、复杂的前处理及专业的操作人员。而胶体金免疫层析技术(Colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)[9-10]具有方便操作、检测快速、不需特殊设备和人员培训等优点，特别适合于大批量的检测。本研究旨在建立一种简便、快速检验原料乳中ZEA的胶体金免疫试纸条检测方法。

1 实验

1.1主要仪器

高速冷冻离心机，紫外分光光度计，恒温磁力搅拌器，恒温鼓风干燥箱，点膜仪，切割机。

1.2试剂与耗材

玉米赤霉烯酮，呕吐毒素、黄曲霉毒素M1，伏马毒素，玉米赤霉烯酮半抗原和蛋白的偶联物(ZEA-BSA)，抗玉米赤霉烯酮单抗，羊抗鼠IgG，氯金酸(HAuCl4·4H2O)，柠檬酸三钠，乙腈，硝酸纤维素膜（NC膜Sartorius CN140），玻璃纤维膜，吸水纸，PVC板。

1.3方法

1.3.1 胶体金的制备及鉴定

用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金[11]，通过控制柠檬酸三钠的添加量（分别2.5,1.5,1 mL），制备不同粒径大小的胶体金溶液。利用透射电镜的照射对胶体金颗粒进行评价。

1.3.2 胶体金标记抗体的条件

采用Mey氏稳定化实验[12]，取16个2 mL EP管，每管加入1 mL胶体金，分为四组做正交实验。用浓度为2 mol/L的K2CO3调节pH值。其中A组不加K2CO3，B组中加入1 μL的K2CO3，C组中加入2 μL的K2CO3，D组中加入3 μL的K2CO3。将抗玉米赤霉烯酮单抗稀释至0.9 mg/mL,每组1号管标记1 μL抗体，2号管标记2 μL抗体，3号管标记3 μL抗体，4号管标记4 μL抗体，混匀后避光静置15 min。各管中加入20 μL质量分数为10%的NaCl，震荡混匀，于避光处静置15 min。保持红色的最低添加组为最少蛋白添加量，在这个基础上的1.2倍为最适蛋白标记量。

1.3.3 胶体金标记抗体

取已制备好的胶体金溶液，按照上述的最佳条件标记抗体,振荡混匀后避光静置15 min。加入质量浓度为100 g/L的BSA溶液100 μL，振荡混匀，避光静置15 min。4℃离心（10 000 r/min，15 min）后弃上清，去除未结合的蛋白质，将沉淀用质量浓度为10 g/L的BSA溶液、体积分数为0.5%的Tween 20、质量浓度50 g/L海藻糖、浓度20 mmol/L硼酸缓冲液(pH=8.0)溶解，4℃保存备用。取200 μL金标抗溶液于长6 mm，宽4 mm的金标垫上，37℃烘干60 min。

1.3.4 检测线及质控线标记条件的确定

将ZEA-BSA分别稀释成质量浓度为0.5，1，2，4，8 mg/mL，喷涂于NC膜上（常规喷量1.0 μL/cm），将羊抗鼠IgG稀释成1 mg/mL喷涂于NC膜上（常规喷量1.0 μL/cm）；上述NC膜组装成试纸条后用PBS（pH=7.4）滴定，选择T线显色能达到肉眼观察要求的最小用量为最佳标记量。

根据T线工作浓度,将羊抗鼠IgG稀释质量浓度为1 mg/mL；按喷量0.2、0.4、0.6、0.8、1 μL/cm包被到NC膜上作为C线,同样与金标垫组装成试纸条后用PBS滴定，根据C线的显色深浅及与T线显色差异程度确定最佳喷量。

1.3.5 试纸条的组装

将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫依次黏在PVC底板上，用切割机将组装好的大卡割成4 mm宽的试纸条，干燥保存。其中吸水垫与NC膜、胶体金结合垫和NC膜、样品垫和胶体金结合垫分别交叠3 ～4 mm。

1.3.6 试纸条检测限的确定

取空白奶样，在样品中加入等体积的乙腈，将提取液进行离心（5 000 r/min，5 min）处理，吸取上清液用于检测。在处理液中添加玉米赤霉烯酮至终质量浓度为0，10，20，30，50，100 ng/mL，用试纸条检测。每个浓度设3个重复，确定检测限。

1.3.7 试纸条的稳定性实验

将试纸条密封存放于37℃、25℃和4℃，观察对试纸条稳定性的影响。每天取出37℃保存的试纸条分别检测0，50，100 ng/mL的ZEA标品溶液；每3天取出25℃保存的试纸条分别检测0、50、100 ng/ml的ZEA标品溶液；每周取出4℃保存的试纸条分别检测0，50，100 ng/mL的ZEA标品溶液，通过检测结果判断试纸条的保质期。

1.3.8 试纸条的特异性实验

通过与结构类似物及其他霉菌毒素的交叉反应试验来研究试剂条的特异性，选用黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、伏马毒素为交叉反应物。

2 结果与分析

2.1胶体金的制备及鉴定

通过电镜扫描，根据颗粒大小、形状是否均一等对胶体金溶液进行扫描鉴定。图1为加入1.5 mL柠檬酸三钠制备的胶体金溶液。胶体金颗粒的大小在25 nm左右，大小均一，且外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，符合制备试纸条对胶体金颗粒的要求。

图1 胶体金颗粒的投射电镜结果

2.2抗体的标记

实验结果显示，K2CO3添加量为2 μL组及抗体添加量为3 μL组金标抗整体能保持红色不变，表明加入的抗体量可与胶体金在此条件下得到最大程度的结合。取1.2倍，即3.6 μL为最适的抗体添加量。同时，紫外检测结果显示该条件下吸光值最高，与原有胶体金溶液最高吸收峰处的偏离较小。

2.3检测线和质控线标记条件的确定

由图2可以看出，当T线质量浓度为2 mg/mL时，检测线显色清晰。由图3中T线、C线显色强度，可以看出标记量为0.8 μL/cm时，控制线显色清晰。

图2 检测线标记条件的确定

图2中，左到右T线标记量为0.5，1，2，4，8 mg/mL。

图3 质控线标记条件的确定

图3中，从左到右C线标记量为1，0.8，0.6，0.4，0.2 μL/cm。

2.4试纸条检测限的确定

试纸条检测限的判定结果如图4，随着玉米赤霉烯酮含量升高，T线的显色强度逐渐变淡。玉米赤霉烯酮质量浓度为0和10 ng/mL时，T线和C线均显色；玉米赤霉烯酮质量浓度大于等于30 ng/mL时，T线不显色。因此确定试纸条的检测限为30 ng/mL。同样，根据T线和C线显色确定该试纸条对原料乳的最低检测限为50 ng/mL。

图4 检测线的确定

图4中，1 ～6分别代表加标样品中玉米赤霉烯酮质量浓度为0，10，20，30，50，100 ng/mL。

2.5试纸条的稳定性实验

该试纸条在4℃和25℃密封保存3个月，仍可以用于检测阳性样品，并且灵敏度没有降低；37℃条件下密封保存的试纸条在15 d内灵敏度保持不变，可满足市场需求，稳定性好。

2.6试纸条的特异性实验

将本试纸条用于黄曲霉毒素M1、呕吐毒素、伏马毒素检测时，C线和T线均显色，呈阴性，说明本试纸条特异性好。

表1 试纸条的特异性

3 结论

通过上述的实验可知，该玉米赤霉烯酮胶体金免疫试纸条的检测时间为10 min，可以通过肉眼值得进行判定。另外，该试纸条灵敏度为30 ng/mL，能满足国标要求。利用试纸条对阴性原料乳和阳性加标样品的检测，结果及重复性好，对于其他毒素无交叉反应，特异性好。同时，由于试纸条检测的操作简单，非专业的技术人员也可以使用，因此非常适用于对于乳品进行初级筛查。

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Development on detection card for determination of Zearalenone in raw milk

DING Mu1，JIANG Xia1，WANG Rui1，SUN Lu-hong1，ZHOU Wen-qi1，ZHAO Yue-ming1，MAN Chao-xin2，JIANG Yu-jun1,2
（1.Northeast Agricultural University Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,College of Food Science and Engineering Harbin 150030,China；2.National Research Center for Dairy Engineering and Technology，Harbin 150028,China）

Gold colloid nanoparticles were prepared with chloroauric acid and sodium Citrate.The colloidal gold nanoparticles labeled with zearalenone monoclonal antibody were coated on the conjugated pad.The artificial antigen ZEA-BSA and goat anti-mouse IgG were jetted on the nitrocellulose membrane,respectively,as test line and control line.The results showed the limit of detection was 30 ng/ml,and the whole test time was about 10 min.None cross activity were observed with other mycotoxins.The method based on the dipstick can be ap⁃plied to rapid detection of zearelenone residues in raw milk.

Zearalenone;gold immunochromatographic assay;raw milk

TS252.7

A

1001-2230（2016）11-0059-03

2016-01-07

国家科技支撑计划课题（2013BAD18B11）；黑龙江省杰出青年科学基金（JC201415）；黑龙江省科研机构创新能力提升专项计划项目（YC13D005）。

丁木（1990-），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

姜毓君