喹烯酮分子毒性机制研究进展

李道稳 ， 林南昌 ， 王福云 ， 李 斌 ， 肖希龙 ， 汤树生

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.福建省安溪县动物疫病预防控制中心 ， 福建 安溪 362400)

喹烯酮分子毒性机制研究进展

李道稳1， 林南昌2， 王福云1， 李 斌1， 肖希龙1， 汤树生1

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.福建省安溪县动物疫病预防控制中心 ， 福建 安溪 362400)

喹烯酮是由中国农业科学院兰州畜牧兽药研究所最新研制的抗菌、促生长药物，其化学名称为3-甲基-2-苯乙烯酮基-喹噁啉-1,4 -二氧化物，分子式为C18H14N2O3，其化学结构式如图1所示。淡黄色或黄绿色粉末，不溶于水，略溶于部分有机溶剂，对光敏感[1]。近些年，有关学者重新对喹烯酮的毒性作用进行了研究与评价，发现喹烯酮在体内外均表现出潜在的遗传毒性，能造成遗传物质的损伤。彗星试验和体外胞质分裂阻断微核试验检测喹烯酮对Vero细胞及HepG2细胞内遗传物质的作用，发现喹烯酮能够引起细胞DNA和染色体的损伤[2]。最新的研究证明，喹烯酮对BALB/c小鼠也具有遗传毒性，且与药物诱导的氧化应激反应有关[3]。刘凤英证明喹烯酮能诱导细胞S期阻滞，引起和染色体损伤[4]。张朝明证实了喹烯酮能引起肝癌细胞HepG2发生凋亡[1]。本文从喹烯酮诱导氧化应激、细胞凋亡、细胞自噬、内质网应激、炎症反应、周期阻滞、肾上腺毒性等信号转导通路来阐述其可能的分子机制，以期为喹烯酮对动物和人的安全性研究及评价提供参考依据。

1 喹烯酮诱导细胞凋亡涉及TNFR1/TNF-α和线粒体凋亡信号通路

喹烯酮能破坏细胞的氧化还原平衡，促使细胞内ROS含量升高，过量的ROS攻击细胞内的DNA，产生氧化性损伤，导致细胞内DNA氧化损伤标志物8-OHdG含量增加。线粒体和受体介导的凋亡途径参与喹烯酮诱导的细胞凋亡。喹烯酮促使细胞内p38磷酸化水平升高，诱发TNF-α的合成增加，进而作用于细胞表面高表达的TNFR1受体，通过招募FADD和Caspae-8形成DISC而活化Caspase-8。活化的Caspase-8剪切Bid蛋白生成tBid，tBid与其他Bcl-2家族蛋白Bax和Bcl-2等共同作用于线粒体，致使线粒体膜通透性增加，引起线粒体膜电位的下降，线粒体功能受损。线粒体膜通透性升高促使线粒体内细胞色素C释放于胞质，与Caspase-9等共同作用剪切Caspase-3使其活化。活化的Caspase-3作用于细胞内凋亡相关底物，或作用于PARP酶原使其发生剪切，失去修复DNA损伤的能力，导致细胞凋亡的发生。Caspase-3的活化也可能是活化的Caspase-8直接作用的结果。JNK信号通路可能参与传递和放大受体途径的凋亡信号。受体途径中可能也有Fas蛋白的参与。p53可能通过调节p21和Bax等蛋白的表达对喹烯酮所致周期阻滞和细胞凋亡进行调节[5]，其作用机制如图2。

图1 喹烯酮化学结构式

2 ML-7加强喹烯酮诱导的细胞死亡通过AKT和MAPK介导的凋亡

ML-7是一种抗癌药，通过对MLCK活性的抑制使得激动蛋白活力降低，从而阻滞了多种癌细胞的增值和迁移。ML-7加强了喹烯酮引起的细胞毒性、内源性和外源性凋亡；ML-7抑制了喹烯酮引起的Akt通路，激发了喹烯酮引起的MAPK家族通路，其中Akt、ERK、JNK起到促生存抑凋亡的作用，而p38 MAPK起到了促凋亡的作用。总的来说，二者间的相互作用将细胞推向了死亡的方向[6]，其作用机制如图3。

3 喹烯酮通过ATF6/DAPK1调节mAtg9a运输引起内质网应激诱导的自噬

喹烯酮能够引起HepG2细胞中以未折叠蛋白反应(UPR)为代表的内质网应激，并且通过内质网应激诱导自噬水平升高。在内质网应激反应过程中UPR的重要分支ATF6被激活，受ATF6转录调控的蛋白DAPK1也同时受到激活。受DAPK1调控的mAtg9的转运也加强。但当ATF6或DAPK受到抑制时，喹烯酮引起的自噬减少。因此，喹烯酮引起的内质网应激刺激了自噬，并且反应由ATF6和DAPK1介导，并通过mAtg9调控自噬小体的生成[7]，其机制见图4。

4 姜黄素降低喹烯酮诱导的细胞凋亡和炎症反应通过激活Nrf2/HO-1通路和抑制NF-kB信号通路

姜黄素(Curcumin)是从姜黄科植物提取的有效成分，抗癌谱广，毒副作用小，价格低廉，还具有抗炎，抗氧化，抗癌等作用。姜黄素预处理能有效增加喹烯酮诱导L02细胞存活率和降低乳酸脱氢酶的活性，降低喹烯酮诱导的氧化应激、线粒体功能失调和凋亡。姜黄素预处理显著减少诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和一氧化氮(NO)合成，下调NF-kB和iNOS mRNA水平，上调Nrf2和HO-1 mRNA水平。HO-1抑制剂(Zinc protoporphyrin IX)显著降低姜黄素的保护作用通过降低Caspase激活和NF-kB mRNA水平。所以，姜黄素可以有效抑制喹烯酮诱导的凋亡，通过激活Nrf2/HO-1通路，抑制NF-kB通路[8]，其机制如图5。

5 喹烯酮诱导线粒体凋亡通过ROS依赖性促进VDAC1多聚化和抑制Wnt1/β-catenin通路信号

VDAC1是一个位于线粒体外膜上的蛋白，它在调节能量代谢和细胞凋亡中发挥着重要作用。VDAC1抑制剂可以有效增加喹烯酮诱导的细胞活性和线粒体凋亡，通过减少VDAC1多聚化，降低细胞色素C的释放和减少Caspase-3、Caspase-9和PARP的剪切。同时，高表达VDAC1增加喹烯酮诱导的VDAC1多聚化和细胞色素C的释放。此外，Wnt1/β-catenin通路激活剂(LiCl)，显著降低喹烯酮诱导的线粒体凋亡，通过恢复Wnt1和β-catenin的表达水平。ROS清除剂(NAC)能阻断喹烯酮诱导的VDAC1的多聚化和抑制Wnt1/β-catenin通路[9], 其机制如图6。

6 喹烯酮诱导肾上腺毒性机制

喹烯酮(QCT)诱导氧化应激，激活Keap1/Nrf2/ARE, JNK, p38 and ERK1/2通路，增加CYP17A1的表达，降低CYP11B2的表达。喹烯酮通过调控PKC和ERK通路来抑制FOS，结果使CYP17和CYP21活性增加，使CYP11B2和NR4A2活性降低，随后降低了醛固酮的产生。喹烯酮诱导氧化应激引起JNK和p38 MAPK介导的凋亡，导致BCL2的上调和醛固酮的降低。喹烯酮产生的氧化应激使其下游的Keap1/Nrf2/ARE通路蛋白发生变化，比如下调HMOX1、NQO1、G6PD、SRXN1和TXNRD1。此外，喹烯酮诱导产生ROS通过下调PFKP、NME1、ECH1、ALDH2、G6PD、TPI1、ENO2和上调NOX1来调控Keap1/Nrf2/ARE通路[10]，其机制如图7。

总结与展望

喹烯酮作为一种新型兽药，因其良好的抗菌活性和促生长效应被广泛使用。从喹烯酮无毒副作用，在动物和细胞实验证明，喹烯酮具有潜在的毒性，对喹烯酮毒性的认识是一个循序渐进的过程。以上综述的研究表明，喹烯酮可以诱导氧化应激、细胞凋亡、细胞自噬、线粒体自噬、内质网应激、炎症反应、周期阻滞、肾上腺毒性等多种毒性反应，涉及TNFR1/TNF-α、AKT/MAPK、ATF6/DAPK1、AKT/TSC2/p70S6K、Nrf2/HO-1/NF-kB、Wnt1/β-catenin和Keap1/Nrf2/ARE等多条信号通路，各信号通路之间既相互关联又相互制约。但喹烯酮作用的靶器官、靶细胞毒性机制的研究尚不明确。近年来研究表明，N→O键的断裂是喹噁啉类药物的主要代谢途径，它产生的自由基包括ROS是导致其毒性的主要原因。但喹烯酮的毒性机制及分子作用机理仍有待完善，喹烯酮的毒性不容忽视，其作为饲料添加剂的安全性还有待更多实验研究进行验证评判。

[1] 张朝明. 喹烯酮致HepG2细胞毒性与凋亡的分子调控机理研究 [D].北京：中国农业大学，2014.

[2] 陈倩. 喹噁啉类药物致HepG2细胞氧化损伤及S期阻滞调控机理研究 [D].北京：中国农业大学，2009.

[3] Wang D, Zhong Y, Luo X,etal. Pu-erh black tea supplementation decreases quinocetone-induced ROS generation and oxidative DNA damage in Balb/c mice [J]. Food Chem Toxicol, 2011 Feb;49(2):477-484.

[4] 刘凤英，靳溪，汤树生，等 喹烯酮诱导HepG2细胞DNA复制相关基因表达水平的变化[J]．癌变·畸变·突变，2011，23(5):325-329.

[5] Zhang C, Wang C, Tang S,etal. TNFR1/TNF-α and mitochondria interrelated signaling pathway mediates quinocetone-induced apoptosis in HepG2 cells [J]. Food Chem Toxicol, 2013 Dec;62:825-838.

[6] Zhou Y, Zhang S, Deng S,etal. ML-7 amplifies the quinocetone-induced cell death through akt and MAPK-mediated apoptosis on HepG2 cell line [J].Toxicol Mech Methods, 2016;26(1):11-21.

[7] Zhou Y, Zhang S, Dai C,etal. Quinocetone triggered ER stress-induced autophagy via ATF6/DAPK1-modulated mAtg9a trafficking [J]. Cell Biol Toxicol, 2016 Apr;32(2):141-152.

[8] Dai C, Li B, Zhou Y, Li D,etal. Curcumin attenuates quinocetone induced apoptosis and inflammation via the opposite modulation of Nrf2/HO-1 and NF-kB pathway in human hepatocyte L02 cells [J]. Food Chem Toxicol, 2016 Sep，95:52-63.

[9] Yang X, Tang S, Dai C, Li D,etal. Quinocetone induces mitochondrial apoptosis in HepG2 cells through ROS-dependent promotion of VDAC1 oligomerization and suppression of Wnt1/β-catenin signaling pathway [J]. Food Chem Toxicol, 2017 Mar 23;105:161-176.

[10] Wang X, Bai Y, Cheng G,etal. Genomic and proteomic analysis of the inhibition of synthesis and secretion of aldosterone hormone induced by quinocetone in NCI-H295R cells [J]. Toxicology, 2016 Mar 28;350-352:1-14.

S816.7

A

0529-6005(2017)10-0077-02

2017-05-25

国家自然科学基金(31372486)

李道稳(1990-)，男，博士生，从事兽医药理及毒理学研究，E-mail：lidaowen@cau.edu.cn

汤树生，E-mail：tssfj@cau.edu.cn