低浓度补肾中药血清联合骨形态发生蛋白-2对人脐血间充质干细胞的生物学作用

王建伟　杨俊锋　张亚峰　郭　杨　顾晓林　马　勇

(无锡市中医医院　南京中医药大学骨伤研究所，江苏　无锡　214000)



低浓度补肾中药血清联合骨形态发生蛋白-2对人脐血间充质干细胞的生物学作用

王建伟杨俊锋张亚峰郭杨1顾晓林1马勇1

(无锡市中医医院南京中医药大学骨伤研究所，江苏无锡214000)

摘要〔〕目的观察低浓度补肾中药血清联合骨形态发生蛋白(BMP)-2对人脐血间充质干细胞(MSCs)体外增殖、成骨分化的生物学作用。方法取正常孕妇脐静脉血培养第3代人脐血MSCs，制备补肾中药大鼠血清，按诱导分化培养基不同，随机分为空白对照组、中药血清组、BMP-2组、中药血清+BMP-2组(联合组)。以MTT比色法检测脐血MSCs增殖活性，观察碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节及Ⅰ型胶原染色以检测细胞成骨分化能力。结果与空白对照组比较，联合组、BMP-2组在诱导第3、5天细胞增殖活性明显提高，在诱导第3、6、9、12天ALP活性明显提高(P<0.05)。与BMP-2组比较，中药血清+BMP-2组在诱导第5天增殖活性明显提高，在诱导第6天ALP活性明显提高(P<0.05)。成骨诱导第14天，除空白对照组外各组von Kossa染色均可见细胞间散在黑色颗粒，尤以联合组为明显；而Ⅰ型胶原纤维表达，BMP-2组、联合组与空白对照组相比均明显增强。结论低浓度补肾中药血清联合BMP-2后能诱导人脐血MSCs增殖及定向成骨分化，是复合型诱导因子的一种理想选择。

关键词〔〕补肾中药；骨形态发生蛋白-2；脐血间充质干细胞；成骨分化；增殖

1南京中医药大学

第一作者：王建伟(1963-)，男，主任医师，教授，博士，博士生导师，主要从事骨折创伤研究。

人脐血间充质干细胞(MSCs)作为来源于中胚层的成体干细胞，由于具有取材方便，免疫源性较低，不易被病毒感染等优点，目前作为组织工程的新型种子细胞在骨创伤缺损的修复方面具有广阔的前景〔1，2〕。然而，在体外培养时由于脐血中MSCs含量较低，其增殖、成骨分化很大程度上依赖于诱导因子的活性。骨形态发生蛋白(BMP)-2是骨形成蛋白家族中诱导成骨分化最强的细胞因子，但由于其费用昂贵，临床运用受到一定限制。目前已有临床研究报道〔3〕，补肾中药血清能明显促进骨髓MSCs增殖及成骨分化，而人脐血MSCs在形态及生物学特性等方面均与骨髓MSCs相似。本实验选取骨碎补、狗脊等14味补肾中药，观察低浓度补肾中药血清能否促进BMP-2诱导人脐血MSCs体外增殖及成骨分化。

1材料与方法

1.1主要实验药物、试剂及仪器补肾中药为我院刘氏骨伤治疗骨折、骨质疏松传承经验方，方剂组成：生黄芪20 g，山萸肉10 g，淫羊藿10 g，骨碎补30 g，狗脊10 g，女贞子10 g，制附子9 g，蛇床子10 g，细辛6 g，白术10 g，白芍20 g，鸡血藤15 g，鹿衔草15 g，生甘草9 g，以上均为颗粒剂，由南京中医药大学附属医院中药房提供(江阴中药厂生产)；BMP-2 (PEPROTECH，USA)；低糖DMEM培养液、胎牛血清(美国Hyclone公司)；MTT试剂盒(凯基生物)；Hepes、二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)；硝酸银溶液(上海化学试剂公司)；Ⅰ型胶原免疫化试剂盒(武汉博士德公司)。紫外分光光度仪(德国Eppendorf公司)，ELx800酶标仪(美国BioTek公司)，倒置式系统相差显微镜(日本 Olympus)。

1.2补肾中药血清制备取清洁级成年雄性SD大鼠18只，体重(200±20)g，均由南京中医药大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK (苏)2008-0004。将补肾中药煎制浓缩成含生药2 g/ml的药液，根据人和动物体表面积折算法计算，按250 mg·kg-1·d-1生药剂量给大鼠灌胃1 w，2次/d，1 w后颈动脉取血，制成5%补肾中药血清，-20℃保存备用。

1.3人脐血MSCs的体外分离、培养及传代脐血取自足月或早产正常分娩的产妇，排除恶性肿瘤、各种传染性疾病，无家族遗传疾病，严格按照无菌要求操作，取脐血前征得产妇及其家属同意，均由南京市妇幼保健院提供。无菌条件下，穿刺脐静脉，抽吸脐静脉血60 ml左右，肝素抗凝。与Hank液1∶1混匀后按2∶1叠加于淋巴细胞分离液面上。离心后吸取环状乳白色淋巴细胞层，以1×106/ml的密度接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养7 d后换液，以后每3天换液1次。当瓶底细胞生长达到80%～90%融合时，按照1∶2进行原代细胞传代培养，传至第3代后进行实验检测。

1.4实验分组选用生长状况良好的第3代细胞，以1×106/孔的密度接种于96孔板，分为四组，每组5个复孔。具体分组：空白对照组：含15%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM完全培养基。中药血清组：向DMEM完全培养基中加入5%补肾中药血清。BMP-2组(联合组)：向DMEM完全培养基中加入50 ng/ml BMP-2。中药血清+BMP-2组：向DMEM完全培养基中加入5%补肾中药血清和50 ng/ml BMP-2。

1.5MTT比色法检测增殖活性于诱导后的第1、3、5天，按照MTT试剂盒说明书，每孔加入1×MTT溶液50 μl，放置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养4 h后终止培养，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，平板摇床振荡10 min后选取490 nm的波长，以酶标仪测定各孔光吸收值(OD值)。

1.6碱性磷酸酶(ALP)活性检测于诱导后第3、6、9、12天，标记3支EP管依次为空白管、标准管和测定管，各管分别加入去离子水、酚标准应用液和细胞上清液各50 μl，然后依次加入缓冲液和基质液各0.5 ml，37℃水浴后依次加入显色剂1.5 ml，最后以520 nm、0.5 cm光径紫光分光仪比色，检测比较各管的吸光度。

1.7矿化结节von Kossa染色于诱导后的第14天，以PBS润洗细胞爬片，4%多聚甲醛溶液固定细胞30 min后用5%硫代硫酸钠溶液置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30 min，吸弃上清液，然后用1%硝酸银溶液紫外线下染色30 min，蒸馏水漂洗后继续用5%硫代硫酸钠染色2 min，然后以1%中性红复染10 min，去离子水再次漂洗后镜下观察。

1.8Ⅰ型胶原免疫组化染色于诱导后的第12天，按武汉博士德公司免疫组化试剂盒说明书，PBS润洗细胞爬片，4%多聚甲醛溶液固定，将细胞爬片放入3%过氧化氢溶液中10 min，然后再次以PBS润洗细胞爬片，依次加入山羊血清工作液、1∶50稀释的鼠抗人Ⅰ型胶原抗体、生物素化IgG抗体、链亲和素标记链霉卵白素工作液，DAB溶液显色，苏木精复染后镜下观察。

1.9统计学方法采用SPSS17.0统计软件，进行单因素方差分析，不满足方差分析条件时采用Wilcoxon秩和检验。

2结果

2.1MTT法检测脐血MSCs的增殖活性与空白对照组比较，联合组、BMP-2组在诱导第3、5天时，细胞增殖活性明显提高(P<0.05)；在诱导第5天时，5%中药血清+ BMP-2组细胞增殖活性优于BMP-2组(P<0.05)。见表1。

表1　MTT比色法检测人脐血MSCs增殖情况

与空白对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与BMP-2组比较：3)P<0.05，下表同

2.2ALP活性检测与空白对照组比较，联合组、BMP-2组在诱导第3、6、9、12天均能明显提高ALP活性(P<0.05)。与BMP-2组比较，联合组在诱导第6天时ALP活性明显提高(P<0.05)。见表2。

表2　各诱导组不同时间点ALP活性比较

2.3矿化结节染色成骨诱导第14天后，von Kossa染色可见细胞间散在黑色颗粒，颗粒大小不均一，提示有矿化基质沉积，空白对照组细胞von Kossa染色未见黑色矿化物沉积，其中联合组较其他各组明显。见图1。

2.4Ⅰ型胶原染色成骨诱导第14天后，细胞外基质Ⅰ型胶原阳性表达为棕黄色颗粒，与空白对照组相比，BMP-2组、联合组Ⅰ型胶原表达明显增强。见图2。

空白对照组

中药血清组

BMP-2组

联合组

空白对照组

中药血清组

BMP-2组

联合组

3讨论

BMP-2作为转化生长因子β超家族的成员之一目前已广泛运用于骨组织工程，其主要机制是促进未分化的干细胞的募集和分化，在骨发生、诱导、修复及骨量保持等方面均起着重要的作用〔4〕。实验研究表明，BMP-2能促进骨髓MSCs增殖、分化及定向诱导成骨，但骨髓MSCs易被病毒污染，且随着年龄增长其增殖、分化能力逐渐下降〔5〕。而人脐血MSCs作为新的种子细胞，具有良好的自我更新能力及多向分化潜能，有效弥补了骨髓MSCs的缺陷，且具有取材创伤小、免疫活性低等优点，目前正成为研究新热点〔6〕。但由于人脐血中MSCs含量较低，BMP-2等作为诱导因子不仅来源有限、费用昂贵，而且其增殖及定向骨化存在一定困难。因此，探讨一种新颖、复合诱导因子有着重要的临床价值。

中医认为：“肾藏精，主骨生髓”。肾精、肾气充足则骨髓化生有源，滋养骨骼，骨骼强健有力；肾精、肾气亏虚则骨髓生化无源，骨骼失养，痿弱无力。由此可见，肾精、肾气的盛衰与骨骼生理、病理有着密切的联系，补肾法可促进骨骼生长、发育。前期我们相关实验研究结果显示，与中、高浓度补肾中药血清比较，低浓度中药血清联合BMP-2作用于人脐血MSCs钙离子浓度、骨钙素(BGP)含量更为显著〔7〕。故本实验选取骨碎补、狗脊、女贞子、淫羊藿等14味补肾中药，制备低浓度补肾中药大鼠血清，联合BMP-2，以MTT比色法检测脐血MSCs增殖活性，观察ALP活性、矿化结节Von Kossa染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色。

MTT比色法〔8〕目前常用于细胞增殖活性的定量检测，由于活细胞线粒体中的呼吸链存在促进MTT还原的琥珀酸脱氢酶，其生成产物蓝色甲臜结晶能在细胞内被DMSO所溶解，通过酶标仪测定OD值的大小来反映细胞增殖情况。ALP主要参与无机磷酸钙的合成，是反映成骨细胞活性的重要指标，而矿化结节和Ⅰ型胶原的形成目前被认为是成骨细胞的特有表现，是骨细胞增殖分化和成骨活性的重要标志〔9〕。本实验证实补肾中药联合BMP-2对人脐血MSCs的综合生物学作用，且补肾中药不能单独作为诱导因子促进干细胞增殖、成骨分化，但联合BMP-2后有明显增效促进作用。

本实验补肾中药具有补肾益髓、强筋健骨功效，其联合BMP-2促进人脐血MSCs增殖及成骨分化，其作用机制可能主要通过调成骨细胞中血管内皮生长因子(VEGF)的表达，激活MAPK家族中的p38蛋白及Smads、BMPs信号通路，刺激成骨细胞的不断增殖和矿化结节和Ⅰ型胶原的表达，最终促进成骨细胞的成骨分化〔10～12〕。

参考文献4

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3毛项颖，卞琴，沈自尹.淫羊藿苷介导MAPK信号通路促进间充质干细胞株C3H10T1/2成骨分化的体外研究〔J〕.中西医结合学报，2012;10(11):1272-8.

4Wagner DO，Sieber C，Bhushan R，etal.BMPs: from bone to body morphogenetic proteins〔J〕.Sci Signal,2010;3(107):124-9.

6Seo KW，Lee SR，Bhandari DR，etal.OCT4A contributes to the stemness and multi-potency of human umbilical cord blood-derived multipotent stem cells (hUCB-MSCs)〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2009;384:120-5.

7蒋涛.基于“肾主骨生髓”理论的补肾中药联合BMP-2诱导人脐血MSCs体外成骨分化的研究〔D〕.南京：南京中医药大学，2012：263-73.

8Mandal S，Lindgren AG，Srivastava AS，etal.Mitochondrial function controls proliferation and early differentiation potential of embryonic stem cells〔J〕.Stem Cells,2011;29(3):486-95.

9Gu Q，Cai Y，Huang C，etal.Curcumin increases rat mesenchymal stem cell osteoblast differentiation but inhibits adipocyte differentiation〔J〕.Pharmacogn Mag,2012;8(31):202-8.

10Bai Y，Li P，Yin G，etal.BMP-2，VEGF and bFGF synergistically promote the osteogenic differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells〔J〕.Biotechnol Lett,2013;35(3):301-8.

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12Hu W，Ye Y，Wang J，etal.Bone morphogenetic proteins induce rabbit bone marrow-derived mesenchyme stem cells to differentiate into osteoblasts via BMP signals pathway〔J〕.Artif Cells Nanomed Biotechnol,2013;10(1):251-63.

〔2014-08-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者：马勇(1963-)，男，博士，主任医师，教授，博士生导师，主要从事创伤骨科研究。

基金项目：江苏省中医药领军人才培养对象资助项目(LJ200924)

中图分类号〔〕R3〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0030-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.013