NM23B对大鼠肝细胞体外增殖的影响

高红强　李志强　王海雷　薛国友　刘　静　陈　刚　李　立

(昆明医科大学附属甘美医院肝胆二科，云南　昆明　650011)



NM23B对大鼠肝细胞体外增殖的影响

高红强李志强王海雷薛国友刘静陈刚李立

(昆明医科大学附属甘美医院肝胆二科，云南昆明650011)

摘要〔〕目的观察NM23B在体外培养大鼠肝细胞增殖中的作用。方法构建NM23B过表达载体和干扰载体及其阴性对照载体，分别转染SD大鼠BRL-3A肝细胞，并设空白对照组(CON)、干扰NC组(siRNA-NC)、干扰组(siRNA)、过表达组(OE)、过表达NC组(OE-NC)，通过定量PCR分析各组细胞中Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA变化；Western印迹分析比较各组细胞中Cyclin D1、NM23B和PCNA蛋白的变化；流式细胞仪检测各组细胞周期比例；用CCK 8法检测细胞增殖。结果OE组Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA及蛋白的表达量较CON组显著增多(P<0.05)；另一方面，siRNA组的Cyclin D1、NM23B和PCNA的mRNA及蛋白的表达量较CON组显著降低(P<0.05)，干扰NC组和OE-NC组与CON组相比无统计学差异(P>0.05)。OE组的G0/G1期细胞比例明显低于CON组(P<0.05)，siRNA组的G0/G1期细胞比例明显高于CON组(P<0.05)。同时，OE组的S期细胞比例明显高于CON组(P<0.05)，siRNA组的S期细胞比例明显低于CON组(P<0.05)，siRNA-NC组和OE-NC组与CON组相比无统计学差异(P>0.05)。CCK-8检测细胞增殖表明OE组的增殖速度明显快于CON组(P<0.05)，siRNA组的增殖速度明显慢于CON组(P<0.05)，siRNA-NC组和OE-NC组与CON组相比无统计学差异(P>0.05)。结论过表达NM23B可以加强Cyclin D1、PCNA的表达，缩短细胞周期，从而促进肝细胞增殖；干扰NM23B表达则削弱了Cyclin D1、PCNA的表达，延长细胞周期，从而抑制肝细胞增殖。证实了NM23B在体外培养SD大鼠肝细胞增殖中的作用，为后续体内实验奠定了理论基础。

关键词〔〕NM23B;大鼠BRL-3A肝细胞;细胞周期;增殖

第一作者：高红强(1981-)，男，住院医师，在读博士,主要从事肝移植临床研究。

肿瘤转移抑制基因NM23是一个多功能基因，目前对其在基因转录、细胞分化、细胞增殖、细胞黏附、细胞迁移、信号转导、个体发育等方面功能的认识日益增多〔1～4〕。NM23目前已发现10个亚型〔5〕，研究最透彻的是NM23A和NM23B，其编码的蛋白分别为NM23B-H1(NDPK A)和NM23B-H2(NDPK B)，两者虽然有88%的相同基因序列，但生物学功能上却存在各自倾向性，NM23A抑制肿瘤转移，NM23B调控基因转录的已经得到共识〔6〕。NDPK B蛋白可以结合正向或负向的转录元件而产生激活或抑制转录的调控效果,还可以通过消除一些扭曲、有潜在抑制作用的DNA结构来调控转录〔7,8〕，这就是NDPK B基因调控功能多样性的分子基础。本研究通过构建NM23B过表达载体及干扰载体，分别转染SD大鼠BRL-3A肝细胞，验证NM23B在体外培养大鼠肝细胞增殖中的作用。

1材料和方法

1.1实验材料大鼠肝细胞系BRL-3A购于昆明动物研究所；Stbl3超级感受态及带GFP的腺病毒由中国医学科学院医学生物学研究所分子流行病学联合实验室制作；DMEM及胎牛血清购自美国Hyclone公司；PCR试剂盒购自广州复能基因公司，PCR引物也由该公司设计；青霉素、链霉素购于美国Millipore公司；蛋白酶抑制剂及PVDF膜购于美国Millipore公司；PMSF、BCA试剂盒购于中国碧云天生物公司；鼠抗人β-actin抗体购自美国Abcam公司，anti-cyclinD1和anti-PCNA购于美国Millipore 公司，anti-NM23-H2购于美国Santa公司；质粒提取试剂盒购自美国OMEGA公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所。

1.2慢病毒质粒构建干扰载体及过表达载体合成委托专业公司广州复能公司完成,并附有干扰及过表达的NC质粒。慢病毒骨架质粒(Tet-pLKO-puro )经EcoRI及AgeI双酶切，胶回收酶切的骨架质粒，与退火形成的双链干扰序列经T4 DNA连接酶连接，并转入Stbl3超级感受态细胞中，挑取3个转化子，活化后进行菌液PCR：上游引物5'-GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA-3'，下游引物5-'TGCCATTTGTCTCGAGGTCG-3'，取阳性菌液再扩大培养行质粒小提得到较纯的重组慢病毒质粒，并筛选出干扰性最好的质粒进行实验。

1.3感染目的细胞实验分为空白对照组(CON)、干扰NC组(siRNA-NC)、干扰组(siRNA)、过表达组(OE)、过表达NC组(OE-NC)。取对数生长的BRL-3A细胞种于六孔板内，第2天细胞汇合度达60%～70%时感染病毒，换含有5%FBS(灭活)和1%双抗，每孔加入500 μl病毒液，并加入8 μg/ml的polybrene。第2天重复感染一次，次日用嘌呤霉素的最低杀死浓度(1 μg/ml)进行筛选。感染72 h后，用荧光显微镜观察荧光。收集细胞:用胰酶(0.25%)消化转染的细胞,将细胞吹打形成单个细胞,加PBS,800 g离心5 min弃上清。再用PBS重新清洗2次。调整细胞密度为1×106/ml,上流式细胞仪检测转染效率，以未转染的细胞作为阴性对照。

1.4PCR检测收集慢病毒感染5 d后的3组细胞，分别取1×106个细胞按RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，将其反转录成cDNA 后进行实时荧光定量PCR(PCR引物序列见表1)，各组样本设3个重复孔。PCR反应条件：第1步，95℃预变性15 s；第2步，95℃变性5 s、60℃退火30 s，共45个循环；以2-ΔΔCt表示目标mRNA的相对表达水平。实验重复3次。

表1　NM23B、PCNA、Cyclin D1引物序列

1.5肝细胞Western印迹分析收集慢病毒感染5 d后的5组细胞，各组分别取1×106个细胞，按蛋白提取试剂盒说明书提供的方法抽提细胞总蛋白,BCA法测定蛋白质浓度。取50 μg/孔蛋白进行电泳,分离后的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h；经TBST充分漂洗后，分别加入目标蛋白抗体；经TBST充分漂洗后，加1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或羊抗鼠二抗，室温反应2 h；经TBST充分漂洗后，应用电化学发光法试剂显色。目的条带与β-Actin蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平，实验重复3次。

1.6流式细胞仪检测细胞周期取慢病毒感染5 d后的5组细胞，以1×105个细胞/孔接种于24孔培养板，每组3个复孔，终体积为500 μl，加入预冷的70%乙醇于4℃固定过夜，PBS洗涤去乙醇，1 000 r/min,5 min，洗2遍，之后用0.5 ml PBS重悬细胞，加入PI和RNaseA至终浓度50 μg/ml，37℃温浴30 min，用流式细胞仪测定细胞周期，实验重复3次。

1.7CCK-8法检测各组细胞增殖情况按试剂盒说明书进行操作：5组各取8个孔进行细胞增殖检测，采用96孔细胞铺板，每孔100 μl 2 000个细胞，第二天进行转染，转染48 h后进行细胞增殖检测。每孔加入10 μl CCK-8溶液，分别用酶标仪检测，在450 nm测定吸光度值，计算出吸光度相对值。

2结果

2.1荧光显微镜观察慢病毒在体外肝细胞的转染情况各组GFP阳性细胞率分别是CON组为(0.245±0.014)%，siRNA组为(86.816±3.536)%，siRNA-NC 组为(83.732±2.437)%，OE组为(89.353±4.239)%，OE-NC组为(91.417±4.725)%，除对照组外，其余各组转染效率均达到后续实验要求，见图1。

A、B、C、D、E为白光照片,F、G、H、I、J为荧光照片图1　荧光显微镜下观察各组转染效果

2.2各组细胞PCR检测OE组NM23B、PCNA及Cyclin D1 mRNA相对表达量较CON组显著增多(均P<0.05)。 siRNA组的NM23B、PCNA及Cyclin D1 mRNA的相对表达量较CON组显著降低(均P<0.05)。而CON组、OE-NC组及siRNA-NC组之间比较无显著差异(P>0.05)。见表2。2.3转染后各组肝细胞Western印迹分析OE组NM23B、PCNA及Cyclin D1的蛋白表达量较CON组显著增多(均P<0.05)。另一方面，SiRNA组的NM23B、PCNA及Cyclin D1蛋白表达量较CON组显著降低(均P<0.05)。而CON组、OE-NC组及siRNA-NC组比较无显著差异(P>0.05)。见表3、图2。

2.4流式细胞仪检测细胞周期OE组的G0/G1期细胞比例明显低于CON组(P=0.001 4)，siRNA组的G0/G1期细胞比例明显高于CON组(P=0.003 4)。同时，OE组的S期细胞比例明显高于CON组(F=542.68,P=0.018)，siRNA组的S期细胞比例明显低于CON组(F=2 655.18,P=0.000 4)；而CON组、OE-NC组及siRNA-NC组间G0/G1期和S期的细胞比例无显著差异(P>0.05)。见表4。

表2　各组细胞NM23B、PCNA、Cyclin D1的

表3　各组细胞NM23B、PCNA、Cyclin D1的

与CON组比较：1)P<0.05，下表同

2.5CCK-8法检测各组细胞增殖OE组在各个时间点的细胞活力(细胞增殖能力)都明显强于CON组(均P<0.05)，而siRNA组在各个时间点的细胞活力(细胞增殖能力)则明显弱于

CON组(均P<0.05)。CON组、OE-NC组及siRNA-NC组间在各个时间点的细胞活力(细胞增殖能力)都无显著差异(P>0.05)。见表5。

图2　各组细胞NM23B、PCNA、Cyclin D1蛋白印迹

组别G0/G1期S期G2/M期KB组49.815±1.93441.346±2.1857.964±1.495siRNA-NC组51.283±2.31642.321±1.9346.317±0.982siRNA组66.719±3.7851)29.453±1.8461)2.753±1.518OE-NC组50.437±1.84639.913±2.3167.985±2.738OE组42.781±1.6371)48.671±1.6371)10.876±1.193

表5　各组细胞行CCK-8检测后吸光度值

3讨论

在活体肝移植、原发性肝癌、肝内胆管结石、肝硬化等情况下行肝部分切除术后常常出现肝脏储备功能不足，导致肝衰竭。肝脏再生是多因子、多通路、多基因共同参与的复杂调控过程〔9〕,如何让有限的功能完好的正常肝细胞最大限度地增殖是解决这个问题的一个思路，这就需要寻找更多的肝细胞增殖的调控靶点。本研究结果发现NM23B的高表达和低表达均能引起Cyclin D1和PCNA表达升高和降低，因此笔者推测NM23B通过直接或间接地调控Cyclin D1和PCNA的表达，从而影响大鼠肝细胞的增殖，至于其中涉及哪些信号通路和调控的分子机制有待进一步研究。流式细胞仪结果说明上调NM23B表达能使大鼠肝细胞快速进入S期，缩短细胞周期，促进细胞增殖；另一方面，降低NM23B表达能阻碍大鼠肝细胞快速进入S期，而停滞于G0/G1期，延长细胞周期，抑制细胞增殖。综上，本研究从正反两个方面阐述了NM23B在体外肝细胞增殖中的作用。由于NDPK B在大鼠和人类之间有着98%的同源性，且在大鼠肝细胞中表达较为丰富〔10〕，因此NDPK B在大鼠肝细胞增殖的研究势必为后续活体研究和人类肝细胞增殖的研究提供坚实的理论基础。

参考文献4

1Otero AS.NM23/nucleoside diphosphate kinase and signal transduction〔J〕.J Bioenerg Biomembr,2000;32(3):269-75.

2Fournier HN,Albigès-Rizo C,Block MR,New insights into Nm23 control of cell adhesion and migration〔J〕.J Bioenerg Biomemb,2003;35(1):81-7.

3Lombardi D,Lacombe ML,Paggi M.NM23B:Unraveling its biological function in cell differentiation〔J〕.J Cell Physiol,2000;182(1):144-9.

4Bilitou A,Watson J,Gartner A.The NM23 family in development〔J〕.Mol Cell Biochem,2009;329(1):17-33.

5Postel EH.Multiple biochemical activities of NM23B/NDP kinase in gene regulation〔J〕.J Bioenerg Biomembr,2003;35(1):31-40.

6Postel EH,Zou X，Notterman DA.Double knockout Nme1/Nme2 mouse model suggests a critical role for NDP kinases in erythroid development.Mol Cell Biochem,2009;329(1):45-50.

7Agou F,Raveh S,Véron M.The binding mode of human nucleoside diphosphate kinase B to single-strand DNA〔J〕.J Bioenerg Biomembr,2000;32(3):285-92.

8Postel EH,Berberich SJ,Rooney JW,etal.NM23B-NDP kinase〔J〕.J Bioenerg Biomembr,2000;32:277-84.

9Riehle KJ,Dan YY,Campbell JS,etal.New concepts in liver regeneration〔J〕.J Gastroenterol Hepatology,2011;26(1):203-12.

10La ML,Milon L,Munier A,etal.The human NM23B/nucleoside diphosphate kinases〔J〕.J Bioenerg Biomemb,2000;32(2):247-58.

〔2015-01-27修回〕

(编辑李相军)

通讯作者：李立(1962-)，男，博士，主要从事肝胆胰外科及器官移植研究。

基金项目：云南省应用基础研究计划-昆明医科大学联合专项重点项目(2012FB010)

中图分类号〔〕R575〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0023-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.010