沙门柏干酪青霉多糖提取工艺优化及其抗冻伤活性研究

刘 冬 叶红玲 李 萍 谭 炜

(1. 安庆职业技术学院，安徽 安庆 246003；2. 安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051)

沙门柏干酪青霉多糖提取工艺优化及其抗冻伤活性研究

刘 冬1叶红玲1李 萍1谭 炜2

(1. 安庆职业技术学院，安徽 安庆 246003；2. 安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051)

利用单因素和Box-Behnken试验对沙门柏干酪青霉胞内多糖提取工艺(水料比、提取温度和提取时间)进行优化，并评价胞内多糖的抗冻伤活性。结果表明：最适水料比、提取温度和提取时间分别为36.7∶1(mL/g)、89.6 ℃和123 min，在该条件下多糖得率约为12%。另外，胞内多糖抗冻伤活性与甘油相当，1%～2%的多糖可显著提高短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌的存活率。

沙门柏干酪青霉；多糖；提取条件；冷冻保护剂

沙门柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)是Camembert 干酪的主要成熟剂，它生长在 Camembert干酪的表面，呈白色[1]。在干酪成熟过程中，沙门柏干酪青霉分泌大量的脂肪酶和蛋白水解酶促进干酪的成熟，并形成Camembert干酪典型的风味和特有的组织结构[2]。目前，关于P.Camemberti的研究主要集中在其对干酪品质的影响[3-4]以及Camembert干酪成熟过程中不同成熟剂菌群间的协同作用等方面[5-6]。此外，研究人员[7]发现P.Camemberti可分泌右旋磷霉素，并具有抑制病原菌的作用；Bizet 等[8]对P.Camemberti菌丝营养成分进行分析，发现其富含糖类、脂类、蛋白质和矿物质，其中糖类总含量为33.3%。目前，关于P.Camemberti胞内多糖提取条件优化的研究，未见报道。本研究拟以沙门柏干酪青霉菌丝体为材料，采用单因素和Box-Behnken试验对胞内多糖提取工艺进行优化，并评价沙门柏干酪青霉胞内多糖对冷冻干燥处理过程中双歧杆菌的保护作用，旨在提高沙门柏干酪青霉胞内多糖的提取率，并为该多糖在益生菌冷冻保护剂领域的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

沙门柏干酪青霉(Penicilliumcamemberti)：美国Mad Millie公司；

短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve1.2213)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis1.1853)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum1.1852)：哈尔滨美华生物技术股份有限公司；

液氮：安庆市华兴化工气体有限公司；

牛肉浸膏、酵母膏、大豆蛋白、蛋白胨：生化试剂；

葡萄糖、95%乙醇、浓硫酸和苯酚等其他化学试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器

分析天平：ATX224型，岛津仪器(苏州)有限公司；

紫外可见分光光度计：752型，上海光学仪器有限公司；

CO2培养箱：311型，美国Thermo公司；

数显恒温水浴锅：HH-4型，常州国胜电器有限公司；

超净工作台：SW-CJ-2FD型，上海博讯仪器公司；

冷冻干燥机：FD-1B-50型，北京博医康实验仪器有限公司；

高速冷冻离心机：ST40R型，美国Thermo公司。

1.2 试验方法

1.2.1 沙门柏干酪青霉菌丝的制备 在液体PDA培养基中接种3～5块沙门柏干酪青霉菌碟，于28 ℃，150 r/min条件下培养72 h。过滤得菌丝球，去除琼脂块，以蒸馏水洗涤3～5遍后，在50 ℃下干燥至恒重得菌丝体备用。

1.2.2 胞内多糖提取工艺 取菌丝(m)置于研钵中，倒入适量液氮研碎。按水料比例30∶1(mL/g)添加70 ℃的热水并将菌丝全部转到烧杯中，将烧杯置于70 ℃水浴锅中保温90 min。冷却至室温，过滤得滤液(V0)，然后加入3倍体积的乙醇(95%)于6 ℃冷藏12 h。在6 ℃，10 000 r/min条件离心10 min，收集多糖沉淀，用适量蒸馏水(V)复溶[9]。

1.2.3 多糖含量测定及得率计算 采用苯酚—硫酸法[10]制作多糖测定标准曲线。取浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL分别加入25 mL比色管中，补蒸馏水至1 mL，以1 mL蒸馏水作空白对照。分别依次加入6%苯酚1 mL，浓硫酸5 mL，室温静置30 min。于490 nm下，测定吸光度值(A)，试验重复3次，取平均值。以葡萄糖浓度为X轴，A值为Y轴绘制标准曲线，得标准曲线方程：A=1.023 1C-0.007 2，R2=0.999 2。将多糖稀释适当倍数(n)，取1 mL样品参考标准曲线制作方法测得吸光度值，代入方程(1)得多糖浓度。

(1)

式中：

P——多糖得率，%；

n——多糖稀释倍数；

C——多糖浓度，mg/mL；

V——多糖溶液体积，mL；

m——菌丝质量，g；

1 000——质量单位换算系数。

1.2.4 单因素试验

(1) 水料比的选择：固定提取温度为70 ℃，提取时间为90 min，称取菌丝置于研钵中，倒入液氮，研碎。分别以10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1(mL/g)的水料比，参考“1.2.2胞内多糖提取工艺”步骤提取胞内多糖。按照“1.2.3多糖含量测定及得率计算”方法获得不同水料比条件下的多糖得率。

(2) 提取温度的选择：固定提取时间为90 min，水料比为40∶1(mL/g)，称取菌丝置于研钵中，倒入液氮研碎。分别以60，70，80，90，100 ℃的水，参考“1.2.2胞内多糖提取工艺”步骤提取胞内多糖。按照“1.2.3多糖含量测定及得率计算”方法获得不同提取温度下的多糖得率。

(3) 提取时间的选择：固定水料比为40∶1(mL/g)，提取温度为90 ℃，称取菌丝置于研钵中，倒入液氮，研碎。分别提取30，60，90，120，150 min，参考“1.2.2胞内多糖提取工艺”步骤提取胞内多糖。按照“1.2.3多糖含量测定及得率计算”方法获得不同提取时间条件下的多糖得率。

1.2.5 Box-Behnken试验 在单因素试验结果的基础上利用Design expert 10设计Box-Behnken试验，并在最优条件下进行验证，试验重复3次。

1.2.6 双歧杆菌冷冻试验 按2 g/L的接种量将短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌冷冻菌粉分别接于50 mL MRS液体培养基中，置于37 ℃静置培养24 h。将双歧杆菌培养物移至50 mL灭菌离心管中，于10 000 r/min 6 ℃下离心10 min，用适量无菌水洗涤3次，分别用5 mL不同质量分数的甘油和多糖溶液复溶双歧杆菌菌体，置于-80 ℃下预冻3 h，然后置于真空冷冻干燥机中在-50 ℃，-20 Pa下干燥12 h，得双歧杆菌菌粉备用。

1.2.7 双歧杆菌计数及活菌存活率计算 双歧杆菌活菌计数参考Ye等[11]报道的方法进行，取冷冻前后的双歧杆菌进行10倍稀释，分别接种于含0.05% LiCl的固体MRS培养基上，置于37 ℃二氧化碳培养箱中培养72 h计数，试验重复3次，每个重复设3个平行。双歧杆菌存活率按式(2)计算：

(2)

式中：

S——双歧杆菌存活率，%；

N1——冷冻前液体菌悬液中双歧杆菌活菌数；

N2——冷冻后菌粉中双歧杆菌活菌数。

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 水料比对多糖得率的影响

由图1可知，水料比在10∶1～40∶1(mL/g)时，多糖得率与水料比成正相关关系，当水料比大于40∶1(mL/g)时多糖得率呈下降趋势。即适宜的水料比在30∶1～40∶1 (mL/g)范围内，此时多糖得率在8.0%～8.1%。

2.2 提取温度对多糖得率的影响

由图2可知，当提取温度在60～90 ℃时，多糖得率随提取温度升高而增加，并在90 ℃达到最大值10.23%。当提取温度大于90 ℃时，多糖得率与温度的增加呈负相关关系，类似的现象在Zhu[12]和Ma[13]等的报道中也被观察到。

图1 水料比对多糖得率的影响

图2 提取温度对多糖得率的影响

2.3 提取时间对多糖得率的影响

提取时间是影响多糖提取得率的重要因素，因为提取液渗透到干物料中以及多糖被浸提出来并扩散到提取液中均需充足的时间[12]。由图3可知，在30～120 min时，多糖得率与提取时间的增加呈正相关性，而后随着提取时间的增加多糖得率基本保持稳定。即适宜的提取时间为120 min，此时多糖得率为10.2%。此外，水料比、提取温度和提取时间之间往往存在交互作用[14-15]，且为获得多糖的最佳提取参数，在单因素结果的基础上用Box-Behnken试验进一步优化提取条件。

2.4 Box-Behnken试验

图3 提取时间对多糖得率的影响

表1 因素水平表

表2 Box-Behnken试验设计与试验结果

表3 二次多项式模型回归系数估计和试验结果方差分析†

Table 3 Estimated regression coefcients for the quadratic polynomial model and the analysis of variance for the experimental results

模型参数系数估计标准误差平方和F值P值模型--32.6658.46<0.0001常数项12.060.11---A0.670.0883.6558.720.0001B0.210.0880.365.820.0466C0.610.0883.0048.350.0002AB-0.0750.120.0230.360.5661AC-0.730.122.1033.870.0007BC-0.450.120.8113.050.0086A2-1.960.1216.09259.30<0.0001B2-0.680.121.9531.370.0008C2-0.830.122.9046.730.0002失拟项--0.0820.310.8167误差--0.35

†R2=0.987，AdjR2=0.97，PredR2=0.944，CV=2.39%。

选择水料比、提取温度和提取时间为变量，并确定它们的水平(见表1)。按表2所列组合进行试验，试验结果见表2。利用Design expert 10.0进行分析，结果见表3。水料比、提取温度和提取时间均对多糖得率有显著影响，且影响程度从大到小依次为水料比>提取温度>提取时间。另外，水料比与提取温度的交互项、提取温度与提取时间的交互项以及三因素的平方项也对多糖得率有显著影响。回归方程为：

Y=12.06+0.67A+0.21B+0.61C-0.075AB-0.73AC-0.45BC-1.96A2-0.68B2-0.83C2。

(3)

模型的方差分析结果见表3，方程(3)的Pmodel<0.000 1、Plose=0.816 7>0.05、R2=0.987、AdjR2=0.970、PredR2=0.944，CV(变异系数)=2.39%<5%。这些表明方程(3)显著、无失拟因素存在，能较好地反应所达三因素与多糖得率之间的真实关系[13]，而且具有良好的重现性[14]。由方程(3)任选A、B和C中的2因素为变量另一因素固定为“0水平”点，作图。多糖得率随水料比、提取温度和提取时间的增加呈现先增加后减少的趋势，且方程(3)存在最大值点(图4～6)。由方程(3)得多糖得率预测最大值为12.2%，此时水料比、提取温度和提取时间分别为36.72∶1(mL/g)、89.59 ℃和122.88 min。为方便验证试验的进行，选择在水料比为36.7∶1(mL/g)，提取温度为89.6 ℃和提取时间为123 min条件下，进行验证实验得多糖得率为12.1%，预测值和试验结果基本一致，进一步确认了模型预测的准确性，即在最优条件下可以得到较高的提取率。

图4 水料比和提取时间交互作用响应面和等高线图

图5 水料比和提取温度交互作用响应面和等高线图

图6 提取时间和提取温度交互作用响应面和等高线图

2.5 多糖对冷冻干燥双歧杆菌的保护作用

冷冻干燥是益生菌菌粉生产的关键步骤，然而冷冻和干燥过程均会对益生菌造成损伤，致使益生菌存活率明显下降[15-16]。为保证益生菌的活力在冷冻干燥过程中使用保护剂提高益生菌的存活率。保护剂按照化学结构分为11类，常用的保护剂为糖类和醇类，如羟乙基淀粉和甘油[15]。多糖也可作为冷冻保护剂减少冷冻干燥对细胞的损伤[15]，沙门柏干酪青霉胞内多糖对冷冻干燥双歧杆菌存活率的影响见表4。未添加保护剂的双歧杆菌存活率在3.28%～3.60%时，结果显示冷冻干燥对双歧杆菌造成了较大的损伤。以甘油作为保护剂可显著提高双歧杆菌的存活率，这与李德斌等[16]的报道一致。与空白相比，质量分数为1%～2%的多糖可显著提高短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌的存活率，最高存活率分别达31.27%，30.40%，30.66%。另外，添加相同浓度的甘油和多糖的双歧杆菌存活率基本一致，表明等质量分数的甘油和多糖对3种双歧杆菌的保护作用相当。即沙门柏干酪青霉胞内多糖可作为双歧杆菌冷冻干燥保护剂的潜在选项。

表4 多糖对冷冻干燥过程中双歧杆菌存活率的影响†

† *表示处理组与空白组相比双歧杆菌存活率在P<0.01下存在显著差异。

3 结论

利用单因素和Box-Behnken试验对沙门柏干酪青霉胞内多糖提取工艺进行优化，得最适水料比、提取温度和时间分别为36.7∶1(mL/g)、89.6 ℃和123 min，在此条件下多糖得率为12.1%。该胞内多糖可降低冷冻干燥处理对双歧杆菌造成的损伤，显著提高双歧杆菌的存活率，其效果与等浓度的甘油相当。然而，起抗冻伤作用的胞内多糖具体组分及其抗冻伤机理尚需进一步研究。

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Optimization for the extraction of polysaccharides fromPenicilliumcamembertiand its antifreeze activity

LIU Dong1YEHong-ling1LIPing1TANWei2

(1.AnqingVocationalTechnicalCollege,Anqing,Anhui, 246003,China;2.AnhuiProvincialFoodandDrugInspectionandResearchInstitute,Hefei,Anhui, 230051,China)

In this paper, the single-factor and Box-Behnken experiments were employed to optimize the extraction parameters of intracellular polysaccharide (IPS) fromPenicilliumcamemberti, i.e. liquid-solid ratio, extraction time and temperature, and the antifreeze activity of IPS was also evaluated. The results showed that the IPS could be best extracted with liquid-solid ratio 36.7∶1 (mL/g) at 89.6 ℃ for 123 min, and the yield of it was about 12%. In addition, the antifreeze activity of IPS was almost equal to glycerol, and the livabilities ofBifidobacteriumbreve,Bifidobacteriuminfantis,Bifidobacteriumbifidumwere significantly improved by 1%～2% IPS.

Penicilliumcamemberti; polysaccharide; extraction condition; cryoprotectants

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.039

安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目(编号：KJ2014A148)；安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目(编号：KJ2015A368)；安徽省教育振兴计划重大教学改革研究项目(编号：2015zdjy181)；安徽省教质量工程项目(编号：2015jtxx157)；教育部高职教育创新发展行动计划项目(编号：XM-16)

刘冬(1982—)，男，安庆职业技术学院讲师，博士。 E-mail:liudong1595693@163.com

2016—10—08