银耳菌糠黑色素微波辅助提取工艺优化及其抗氧化活性

师 萱 阎 语 梁旭明 谭红军 杨 勇 钟 耕 石文娟

(1. 重庆市中药研究院，重庆 400065； 2. 西南大学食品科学学院，重庆 400716；3. 银耳营养食品企业工程技术研究中心，重庆 409000)

银耳菌糠黑色素微波辅助提取工艺优化及其抗氧化活性

师 萱1阎 语2梁旭明1谭红军1杨 勇1钟 耕2石文娟3

(1. 重庆市中药研究院，重庆 400065； 2. 西南大学食品科学学院，重庆 400716；3. 银耳营养食品企业工程技术研究中心，重庆 409000)

银耳菌糠；黑色素；微波；分离纯化；光谱特性；抗氧化活性

黑色素(Melanins)是目前已知生物色素中含量最多、分布最广的一类色素，广泛存在于动植物和微生物中[1-2]。它由酚类和/或吲哚聚合物聚合而成，一般难溶于水、酸和有机溶剂，易溶于碱溶液[3]，具有抗氧化[4-6]、抗癌[7]、抗蛇(蝎、蝙蝠)毒[8]、抗病毒[9-10]、抗辐射[11]等作用，在医学、药学、日用化工、食品及其它领域有很大的应用潜力。

随着银耳生产的产业化、工厂化的蓬勃发展，中国每年产生的大量银耳菌糠不但得不到合理的利用，还造成环境污染，同时也造成资源极大浪费[12]。2014年，中国银耳产量达到39.5万t，消费量也达到38万t，每生产1 kg的食用菌，大约可产生5 kg的菌糠[13]，因此如何正确处理和综合利用银耳栽培废料有待于深入开发和研究。银耳栽培过程中存在一种“伴生菌”香灰菌，当菌丝生长到一定阶段后会产生大量黑色素。天然黑色素由于其来源的多样性和复杂性给提纯带来一定困难[14]，而且因提纯方法不同黑色素性质也有所不同。目前，仅有一篇专利报道[15]银耳菌糠黑色素常规提取、高温高压提取、超声辅助提取方法研究，但未见微波辅助提纯研究以及对所提银耳菌糠黑色素性能分析的报道，其方法存在提取时间长、溶剂耗量大、能源消耗高等不足。

微波辅助提取黑色素方法具有溶剂耗量较少、安全、污染小、提取率高等优点[16-17]。本试验拟通过单因素试验与正交试验设计法对银耳菌糠黑色素微波辅助提取工艺进行优化，并对黑色素进行初步纯化、结构鉴定和体外抗氧化活性研究，以期为银耳菌糠功能活性的深入研究、增值利用和产业化应用提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

银耳菌糠：重庆黔江朵朵润尔营养食品股份有限公司，于低温避光通风处保存备用；

溴化钾：色谱纯，成都西亚试剂有限公司；

邻二氮菲和连苯三酚：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；

DPPH(2，2-二苯基-1-苦基肼)：分析纯，上海华蓝化学科技有限公司；

七水合硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

紫外—可见光分光光度计：UV-2450型，日本Shimadzu公司；

数显恒温水浴锅：HH-4型，金坛市富华仪器有限公司；

真空冷冻干燥机：FD-1型，北京德天佑科技发展有限公司；

傅里叶变换红外光谱仪：Spectrum GX型，美国Perkin-Elmer公司；

电子分析天平：FA2004A型，上海恒平科学仪器有限公司；

pH计：PHS-3C型，上海盛磁仪器有限公司；

微波快速制样系统：MSA-II型，上海新仪公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌糠黑色素色价的测定 精确称取菌糠黑色素粗品0.100 0 g，溶于pH 8的NaOH缓冲溶液中，并定容至100 mL，摇匀。从中吸取5 mL黑色素溶液，用同样的缓冲溶液定容至100 mL，在最大吸收波长209 nm下测定其吸光度[18]。黑色素的色价值按式(1)计算：

(1)

式中：

A——吸光度；

m——样品质量，g；

r——测定吸光度时所吸取样品的稀释倍数。

1.2.2 提取工艺单因素试验

(1) 料液比对菌糠黑色素提取效果的影响：称取粉碎后的菌糠5.00 g于烧杯中，用1 mol/L的氢氧化钠溶液分别按料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50(g/mL)加入。60 ℃ 水浴浸提2 h。微波功率320 W，处理时间60 s。4 000 r/min 离心10 min并过滤。滤液用1 mol/L盐酸调pH为2使黑色素沉降，4 000 r/min离心15 min得沉淀[19]。沉淀用蒸馏水洗涤，放真空干燥箱40 ℃干燥。测定计算黑色素色价。

(2) 碱液浓度对菌糠黑色素提取效果的影响：称取粉碎后的菌糠5.00 g于烧杯中，分别用0.00，0.50，1.00，1.50，2.00 mol/L 的氢氧化钠溶液按料液比1∶40(g/mL)加入，后续处理同1.2.2(1)。

(3) 水解时间对菌糠黑色素提取效果的影响：称取粉碎后的菌糠5.00 g于烧杯中， 按料液比1∶40(g/mL)加入1 mol/L 的氢氧化钠溶液。分别于60 ℃水浴浸提1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，后续处理同1.2.2(1)。

(4) 微波处理时间对菌糠黑色素提取效果的影响：称取粉碎后的菌糠5.00 g于烧杯中，按料液比1∶30(g/mL)加入1 mol/L的氢氧化钠溶液。60 ℃水浴浸提2 h。于微波功率320 W下，分别处理0，30，60，90，120 s。后续处理同1.2.2(1)。1.2.3 正交试验 系统考查提取工艺参数对提取结果的影响，根据单因素试验结果，选取因素的不同水平，以黑色素色价为评价指标，采用L9(34)正交进行正交试验确定最佳提取工艺。

1.2.4 银耳菌糠黑色素的纯化 参考文献[14]和[20]，并略有修改。准确称取5.0 g黑色素粗提物，放入烧杯并加入7 moL/L HCl 50 mL，于60 ℃水浴处理3 h后(用保鲜膜将烧杯口密封，以解决溶剂减少可能会带来的影响)，4 000 r/min离心沉淀15 min，沉淀物用蒸馏水洗涤3次，溶于pH 8.0的氢氧化钠溶液。加入1倍体积的氯仿异戊醇(1∶5)混合，经多次振荡后离心，收集上层液体，重复操作3次。用1 mol/L盐酸将所收集液体pH调至2.0，同上离心，沉淀物依次用无水乙醇、95%浓度乙醇、75%乙醇洗涤3次，再次同上离心收集沉淀。沉淀物经蒸馏水洗涤3次，冷冻干燥，存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.5 银耳菌糠黑色素的光谱特征分析

(1) 紫外—可见光谱扫描：称取少量纯化黑色素溶于0.01 mol/L 氢氧化钠溶液中，超声波辅助溶解，取波长190～550 nm处进行紫外—可见光谱扫描[21]。

(2) 傅里叶红外变换光谱扫描：采用溴化钾压片法。黑色素和溴化钾按1∶20的质量比例混匀，研成细粉，压片。在500～4 000 cm-1范围内测定其红外吸收光谱[22]。

1.2.6 银耳菌糠黑色素抗氧化活性研究

(1) DPPH自由基清除能力：根据文献[23]，修改如下：取一定浓度(0.1～2.0 mg/mL)的样品甲醇溶液3 mL，加入5 mL 6.34×15 mol/L DPPH·乙醇溶液，混匀后在室温下静置30 min，测定517 nm处的吸光值A。DPPH自由基清除率按式(2)计算：

(2)

式中：

R——清除率，%；

A0——空白在 517 nm 处的吸光度；

A1——样品在 517 nm 处的吸光度。

2 结果与分析

2.1 银耳菌糠黑色素提取单因素试验结果

2.1.1 料液比对银耳菌糠黑色素提取效果的影响 由图1可知，随着提取料液比增大，黑色素色价也随之升高，并在料液比为1∶40(g/mL)时达到最大，这是因为随着提取溶剂使用量的增大，银耳菌糠中黑色素完全被湿润，提取溶剂促使黑色素溶解饱和。若提取溶剂量过大，将会产生过多的杂质，影响下一步的酸沉，同时可能造成不必要的浪费。因此，初步选定料液比1∶40(g/mL)。

不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著(n=3)

2.1.2 碱液浓度对银耳菌糠黑色素提取效果的影响 由图2可知，随着提取溶剂碱液的增加，黑色素色价增加到一定值后增速缓慢，在1.5 mol/L达到最大，但考虑到黑色素因提取碱液浓度增大继而溶出杂质越多，甚至引发黑色素与别的物质反应，同时碱液浓度过大不利于下一步的酸沉和纯化，因此，初步选定碱液浓度为1.5 mol/L。

不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著(n=3)

2.1.3 水解时间对银耳菌糠黑色素提取效果的影响 由图3可知，随着水解时间的延长，黑色素色价逐渐增大，水解时间为2.5 h时黑色素色价达到最高，但水解时间2.0～2.5 h黑色素色价变化不明显，随之黑色素色价值降低，可能在水解过程中改变了黑色素的化学结构[25]，导致黑色素色价值下降。虽然水解时间2.0～2.5 h时黑色素色价值差异不显著，但也存在缓慢的增长趋势，因此，初步选定水解时间为2.5 h。

不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著(n=3)

2.1.4 微波处理时间对银耳菌糠黑色素提取效果的影响

由图4可知，随着微波处理时间的增加，黑色素色价呈现先增大后减小的趋势，在60 s时达到最大，并随着微波处理时间的延长，黑色素色价呈现明显的降低趋势。这可能是较长时间的微波处理导致温度升高，破坏了黑色素成分。因此，初步选定微波处理时间为60 s。

不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著(n=3)

2.2 银耳菌糠黑色素提取工艺优化的正交试验

根据单因素试验的结果，选取影响黑色素提取效果的因素水平做正交试验，并对结果进行极差分析，以确定最佳的提取条件。采用L9(34)正交表，以料液比、碱液浓度、水解时间、微波处理时间作为4个考察因素，选取3个水平(见表1)进行试验。按表1 的正交因子水平设计L9(34)正交试验，结果见表2。由表2可知，各因素对银耳菌糠黑色素提取效果的影响程度顺序为：碱液浓度>料液比>水解时间>微波处理时间，最优的因素水平组合为A3B3C3D2。为了确定正交试验最佳组合的再现性，进行最佳组合的平行验证实验，即料液比1∶45(g/mL)，氢氧化钠浓度1.75 mol/L，水解时间3 h，微波处理时间60 s，此条件下黑色素的平均色价为153.5。与正交试验6号测得的黑色素色价的组合156.6相比，最佳的提取条件所得黑色素的色价较低。这说明在优化的同等试验条件下料液比过大和水解时间过长时，反而影响银耳菌糠中提取效果，致使黑色素的色价值更低，可能是因为用碱液作溶剂提取黑色素的过程其实也是一个化学过程，当碱液浓度和水解时间适宜时，可以获得较多黑色素，但当碱液浓度过大和水解时间过长时，可能会出现更多的杂质或者引发黑色素与别的物质反应，与陈松等[26]试验结论相一致，同时与单因素试验结论相吻合。因此，银耳菌糠黑色素最好的提取条件为料液比1∶40(g/mL)，氢氧化钠浓度1.75 mol/L，水解时间2 h，微波处理时间60 s。

表1 正交试验因素水平表

表2 L9(34)正交试验结果

2.3 银耳菌糠黑色素纯化及其结构分析

2.3.1 黑色素纯化 经分离纯化后的黑色素呈深黑色，无定形粉末，带有金属光泽。纯化后黑色素的色价为316.0，是纯化前的200%，表明纯化后黑色素的色价有了很大提高。

2.3.2 黑色素的紫外—可见光谱特征 由图5可知，黑色素在紫外光区有着较强的吸收，290～295 nm范围内有最大特征吸收峰。从最大吸收峰位置开始，随着波长的逐渐增大，吸光度呈下降趋势，是典型的黑色素紫外吸收图像，与P Manivasagan等[27]报道的黑色素紫外扫描图是一致的。

2.3.3 黑色素的红外光谱特征 黑色素是一种生物大分子物质，其红外光谱是由多种官能团振动所形成的宽而强吸收峰，相对缺乏官能团特征性。由图6可知，银耳菌糠黑色素在1 617.90，1 514.39 cm-1附近有较强的吸收峰，是由芳环骨架振动引起，在860～650 cm-1范围内的吸收带变弱，是由于芳环被取代并形成共扼体系，芳氢随之相对减少；在3 250.66 cm-1附近存在较宽较强共扼吸收峰，可能是—OH和—NH之间的氢键连接及基团伸缩振动引起，说明分子中含有羟基(—OH)和氨基(—NH)结构；在1 650～1 710 cm-1的较强吸收峰，说明分子中有羧基(—COO)结构，3 400 cm-1处的强吸收峰，与大量的芳环基团(C═O，C═C)的振动有关，说明羧酸根(—COOH)官能团的存在[19,28]。从红外谱图类似性的官能团初步推断银耳菌糠黑色素归为3，4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)类的黑色素。

图5 黑色素的紫外—可见光谱图

图6 黑色素红外扫描图谱

2.4 黑色素抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基的清除能力 由图7可知，提纯的黑色素对DPPH自由基的清除能力随浓度升高而增强，黑色素浓度与DPPH自由基清除率的线性回归方程为：y=23.84x+8.424，r2=0.997，通过计算，得出该黑色素对DPPH自由基的半抑制浓度(IC50)为1.74 mg/mL。

不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著(n=3)

不同的小写字母表示在0.05水平上差异显著(n=3)

3 结论

本研究采用单因素与正交试验对银耳菌糠黑色素微波辅助碱溶酸沉法的提取工艺参数进行了优化，其最佳提取工艺条件为料液比1∶40(g/mL)、提取碱液浓度1.75 mol/L、水解时间2 h和微波处理时间60 s，在此条件下所得黑色素粗提物的色价为156.6，纯化后的黑色素色价达到316.0。本研究证实了此方法有助于银耳菌糠黑色素提取纯化，新增有效提取银耳菌糠黑色素的方法，具有提取时间较短、能耗较低、溶剂消耗较低等优点，在提取过程中也同样表现出黑色素的不稳定性，易改变黑色素的结构，从而影响黑色素的提取效果，同时，银耳菌糠因培养基不同而不同，黑色素的提取工艺研究工作需更深入、更细致。

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Study on extraction process and antioxidant activity of melanin fromTremellafuciformisresidue

SHI Xuan1YANYu2LIANGXu-ming1TANHong-jun1YANGYong1ZHONGGeng2SHIWen-juan3

(1.ChongqingAcademyofChineseMateriaMedica,Chongqing400065,China; 2.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China;3.EnterpriseEngineeringResearchCenterforTremellaNutritionFood,Chongqing409000,China)

Melanin was extracted by alkali solution and acid extraction method with the assistance of microwave fromTremellafuciformisresidue. The separation and purification was optimized. The spectral characteristics and antioxidant activities of melanin were researched. The results showed that the optimum process of extracting melanin fromTremellafuciformisresidue by alkali solution and acid extraction method with the assistance of microwave were as follows: amount of extraction solvent to yield 1∶40，concentration of NaOH 1.75mol/L,hydrolyzing time 2 h,microwave treatment time 60 s,In this condition color value of melanin extracted from Tremella fuciformis residue was 156.6,and was 316.0 after purification.By spectroscopic,melanin from Tremella fuciformis residue was identified to be DOPA.The half clearance rates of DPPH radical and ·radical were 1.74,1.08mg/mL,respectively.

Tremellafuciformisresidue; melanin; microwave; separation and purification; spectral properties; antioxidant activity

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.035

重庆市基本科研业务费计划项目(编号：2014cstc-jbky-01902)

师萱，女，重庆市中药研究院助理研究员，硕士。

钟耕(1964—)，男，西南大学教授，博士后。 E-mail：zhongdg@126.com

2016—08—17