人类微小RNA-1246慢病毒抑制载体的构建及对宫颈鳞癌细胞增殖和侵袭的影响▲

赖月华 姚德生 杜 萍 卢 艳

(广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科二病区，南宁市 530021，E-mail：1312867791@qq.com)

论著·基础研究

人类微小RNA-1246慢病毒抑制载体的构建及对宫颈鳞癌细胞增殖和侵袭的影响▲

赖月华 姚德生 杜 萍 卢 艳

(广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科二病区，南宁市 530021，E-mail：1312867791@qq.com)

目的 构建并鉴定微小RNA(miRNA)-1246慢病毒抑制载体，并探讨miRNA-1246下调对宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响。方法 针对miRNA-1246成熟体的反义核苷酸片段设计引物并合成目的基因miRNA-1246-down，应用基因重组技术将目的基因克隆到空载质粒GV280中，通过酶切、PCR、DNA测序验证重组慢病毒质粒(GV280-miRNA-1246-down)的构建是否成功，将GV280-miRNA-1246-down、Helper 1.0、Helper 2.0共转染293T细胞获得重组慢病毒，浓缩提纯病毒液并检测病毒滴度，再用重组病毒液感染宫颈鳞癌细胞SiHa，通过检测绿色荧光蛋白(GFP)验证GV280-miRNA-1246-down在SiHa细胞的表达情况，用嘌呤霉素筛选GV280-miRNA-1246-down稳转细胞株。将SiHa细胞分为空白组(NC组)、阴性病毒组(NC-LV组)、miRNA-1246下调组(miRNA-1246-down-LV组)，用细胞计数的方法检测细胞的生长率，用Transwell检测细胞侵袭能力。结果 (1)对菌落进行PCR鉴定筛选构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确。(2)慢病毒将目的基因miRNA-1246-down成功导入SiHa细胞中，同时达到稳定表达，转染率达90%以上，在荧光显微镜下能直接观察到GFP。(3)miRNA-1246-down-LV组 SiHa细胞增殖数低于其他两组(P<0.05)，细胞穿膜次数较其他两组减少(P<0.05)。结论 miRNA-1246慢病毒抑制载体构建成功，miRNA-1246稳定下调的SiHa细胞株建立成功。在SiHa细胞中miRNA-1246下调可抑制宫颈鳞癌SiHa细胞的增殖以及侵袭能力。

宫颈癌；慢病毒；微小RNA；抑制载体；增殖；侵袭

微小RNA (microRNA，miRNA)是一类由20～23个碱基组成的非编码单链RNA，其与靶基因mRNA非翻译区域的碱基互补配对，结合形成沉默复合体使mRNA降解，从而阻碍mRNA的翻译[1]。miRNA的功能与细胞的分化、增殖、凋亡、耐药、侵袭及转移等密切相关[2]。肿瘤的多种生物学行为受到miRNA调控。笔者的前期实验结果表明在宫颈癌患者的宫颈癌组织中miRNA-1246的表达量较癌旁组织、人宫颈正常组织升高；miRNA-1246是一个促癌因子，对人宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移能力具有一定的影响[3]。慢病毒载体是将人类免疫缺陷I型病毒改良后发展起来的用于基因治疗的载体，是反转录病毒的一种，它对非分裂细胞和分裂细胞均具有较强的感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。由于对该病毒进行了改良，使之失去了传染性能，因此安全性高。我们构建了miRNA-1246慢病毒抑制载体，作为干预宫颈鳞状细胞癌生长及体内试验的措施之一，为进一步观察miRNA-1246在宫颈鳞状细胞增殖中的作用及其机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源以及培养：人胚胎肾细胞(293T)、人宫颈鳞状细胞癌细胞(SiHa细胞)均购于上海中国科学院。293T细胞用含10%的胎牛血清的DMEM培养基培养，SiHa细胞用含10%的胎牛血清的1640培养基培养。

1.1.2 质粒及菌株：携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的慢病毒载体GV280以及Helper1.0、Helper2.0购自上海吉凯基因科技有限公司。GV280具有EGFP标志和氨苄西林抗药基因。感受态大肠杆菌DH5α菌株购于北京天根生物科技公司。

1.1.3 主要试剂：AgeⅠ及EcoRⅠ限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司(生产批号：RO541V、RO552V、M0202L)；DL 10 000 DNA Marker购于上海TaKaRa公司(生产批号：l111042)，2×Taq PCR Master Mix购于上海吉凯基因科技有限公司，PCR引物合成及质粒测序由上海吉凯基因科技有限公司进行(货号：QPP01/QPP02)。质粒DNA提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自北京天根生物科技公司(货号：DP115-01)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成：根据miRBase数据库(http：//www.mirbase.org/cgi-bin/query.)得到人类miRNA-1246 AAUGGAUUUUUGGAGCAGG(序列编号：MIMAT0005898)，根据DNA重组要求及相关文献[4]设计抑制载体：上游引物5′AATTCAAAAAA-ATGGATTTTTGGAGCAGG-3′，下游引物5′-CCGG-CCTGCTCCAAAAATCCATT-3′。在上游引物的5′端及3′端分别加入限制性内切酶AgeⅠ及EcoRⅠ酶切位点及相应的保护碱基，在上游引物的3′端加入6个T作为终止子。

1.2.2 重组慢病毒质粒的构建： 利用上述合成的引物合成目的基因(miRNA-1246-down)，并对目的基因进行PCR扩增，对GV280空载质粒以及扩增得到的目的基因用限制性内切酶AgeⅠ及EcoRⅠ进行双酶切酶切，按照酶切说明书操作，置于37°反应3 h或过夜，对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，并测定其浓度。GV280空载质粒与目的基因双酶切线性化载体以1 ∶2的比例在T4DNA连接酶作用下进行连接，按照说明书操作，16°连接3 h或过夜。连接产物直接转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布于含氨苄霉素的Luria-Bertani固体培养基的平板上孵育，37° 5%的CO2培养过夜。

1.2.3 重组慢病毒质粒的鉴定：挑取Luria-Bertani固体培养板上长出的单颗阳性菌落行PCR鉴定，并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，引物为载体测序引物，对获得的重组质粒GV280-miRNA-1246-down插入的目的基因miRNA-1246-down进行自动测序，并与miRNA-1246反义核苷酸序列比较。将正确插入载体质粒的转化菌放入500 ml含氨苄霉素的Luria-Bertani培养液中进行扩大培养，37°振荡过夜，用无内毒素质粒大提试剂盒按照说明书提取质粒，测定浓度和纯度，用作以后的转染。

1.2.4 GV280-miRNA-1246-down重组质粒表达绿色荧光蛋白的检测：GV280-miRNA-1246-down重组质粒与lipo2000脂质体以2 ∶1比例混合转染293T细胞，于转染24 h后在荧光显微镜下可观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表达。

1.2.5 重组慢病毒的包装：将GV280-miRNA-1246-down重组质粒以及包装质粒Helper1.0、Helper2.0以一定的比例混合用lipo2000脂质体介导共转染293T，8 h后跟换为含10%胎牛血清的培养基，72 h后收集培养液上清，1 500 r/min离心5 min去除细胞碎片。再用孔径为0.45 μm的一次性细胞滤器过滤去除所有的细胞及碎片，获得的培养基上清则为含有目的基因的重组慢病毒液。

1.2.6 重组慢病毒滴度检测：采用逐孔稀释法，测定前1 d，将293T细胞接种于96孔板，每孔加入4×104个细胞，体积100 μl。分为8个组，第1组加入的病毒原液为10 μl记为1E+0 μl；第2组将病毒原液稀释10倍后加入10 μl病毒稀释液则所得的病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E-1 μl，以此类推第3组到第8组分别为1E-2 μl、1E-3 μl、1E-4 μl、1E-5 μl、1E-6 μl、1E-7 μl感染病毒液，24 h后在显微镜下观察细胞荧光数，则该病毒的滴度等于发荧光的细胞数除以病毒的原液量。

1.2.7 重组慢病毒感染SiHa细胞：感染前先做预实验检测SiHa细胞的moi值。感染前1 d将SiHa细胞以5×104/ml的密度接种于24孔板(细胞融合率为30%～40%)，分为3个组，标记为空白组(NC组)、阴性病毒组(NC-LV组)、miRNA-1246下调组(miRNA-1246-down-LV组)，感染前1 h换成增强感染液,然后按预实验所得moi值向NC-LV、miRNA-1246-down-LV组中分别加入预先与聚凝胺混合好的阴性慢病毒以及GV280-miRNA-1246-down重组慢病毒，8 h后换成有血清培养基，分别于24 h、48 h、72 h在荧光显微镜下观察细胞荧光表达量。

1.2.8 SiHa细胞中miRNA-1246稳定下调细胞系的构建：重组慢病毒感染SiHa细胞72 h后当细胞长满到90%以上时，将细胞用胰酶消化，1 200 r/min离心5 min，用含有2 μg/ml嘌呤霉素的培养基制成悬浊液种到6孔板中(预实验检测得嘌呤霉素筛选的最适浓度为2 μg/ml)，每天用2 μg/ml嘌呤霉素的培养基换液。

1.2.9 细胞增殖实验及细胞侵袭实验：(1)将NC、NC-LV、miRNA-1246-down-LV 3组中长到80%生长对数期的细胞消化收集种于96孔板，每孔细胞约3 000个/100 μl，每组3个复孔，每个板3组细胞，种6个板。接种后48 h起开始消化收集细胞进行计数，每隔24 h一次，连续6 d。消化后的细胞加入台盼蓝，盼蓝拒染法进行细胞计数，并绘制生长曲线。(2)将NC、NC-LV、miRNA-1246-down-LV 3组的细胞培养到80%处于生长对数期时，以2万/每孔接种于Transwell小室上室，下室加入500 μl含15%胎牛血清的1640培养基，每组重复3个复孔，置于细胞培养箱总孵育12～15 h，用4%的多聚甲醇固定后苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色。染色置于显微镜镜下观察并拍照，每个小室在显微镜下分别取上、中、下、左、右 5个视野，并在镜下计数每个视野穿膜的细胞数，肿瘤细胞的侵袭能力以每视野细胞的平均数值来表示，此实验重复3次。

1.3 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行分析，计量资料以(x±s)表示，多组均数间的比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 阳性菌落PCR产物电泳结果 对Luria-Bertani培养板上的菌落进行PCR筛选鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳，如图1所示，1～8号阳性转化子片段大小在250～500 bp之间，而本实验所用的目的基因(miRNA-1246-down)片段大小为271 bp，阳性转化子所含基因片段大小符合目的基因片段大小，可推断出目的基因成功转入到阳性菌落中。

图1 菌落PCR产物电泳结果图

注：从左到右12个通道，1：阴性对照(ddH2O)；2：阴性对照(空载自连对照组)；3：阳性对照(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)；4：Marker，自上而下依次为5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 Kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；5～12：为1～8号转化子。

2.2 载体测序结果 载体经测序证实结果符合预期，插入目的基因(miRNA-1246-down)片段与线性载体连接正确，符合设计要求，未见碱基缺失或突变等异常，证实已成功构建此两类载体，借助Vector NT软件，将序列导入，绘制质粒GV280-miRNA-1246-down结构图。见图2。

图2 重组慢病毒质粒

注：puro：嘌呤霉素抗性基因；Amp：氨苄霉素抗性基因；miRNA-1246-down：目的基因；polyA：多聚腺苷酸；IRES：基因表达启动子。

2.3 GV280-miRNA-1246-down重组质粒转导效率的检测结果 用GV280-miRNA-1246-down重组质粒转染293T细胞，转染48 h后荧光显微镜下可观察到100%的活细胞表达GFP(见图3)，提示重组质粒可在293T细胞中成功表达。

2.4 SiHa细胞中miRNA-1246稳定下调细胞系的构建结果 重组慢病毒miRNA-1246-down-LV感染SiHa细胞72 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达率只有50%，经嘌呤霉素筛选后荧光显微镜观察GFP表达率几乎为100%，成功构建了miRNA-1246稳定下调的SiHa细胞系。见图4及图5。

图3 重组质粒转染48 h后的293T细胞

注：A：倍普通显微镜下图(100×)，B： 494 nm绿色激发光荧光显微镜下图(100×)。

图4 重组慢病毒miRNA-1246-down-LV感染72 h后的SiHa细胞(嘌呤霉素筛选前)

注：A：倍普通显微镜下图(200×)；B： 494 nm绿色激发光荧光显微镜下图(200×)。

图5 重组慢病毒miRNA-1246-down-LV感染后的SiHa细胞(经嘌呤霉素筛选后)

注：C：倍普通显微镜下图(200×)；D： 494 nm绿色激发光荧光显微镜下图(200×)。

2.5 细胞增殖实验结果 将3组细胞个孔进行细胞计数后取均值如表1，将3组细胞计数均值进行比较，我们发现通过感染miRNA-1246-down-LV慢病毒后，SiHa细胞的增殖能力明显较NC组及NC-LV组细胞增殖能力减弱，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1及图6。

2.6 细胞侵袭实验结果 转染了miRNA-1246-down-LV组SiHa细胞穿膜数量为(44.24±8.18)个，NC-LV组细胞穿膜数为(112.17±21.94)个，NC组细胞穿膜数为(112.60±16.93)个。miRNA-1246-down-LV组较其他两组明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图7。

表1 各组细胞增殖情况(x±s，个)

图6 细胞生长曲线图

图7 各组穿过膜的SiHa细胞(HE染色，×40)

3 讨 论

最新研究表明miRNA参与动物包括人类生理或疾病状态的调节，这其中包括细胞死亡或凋亡以及肿瘤的发生、发展以及炎症反应等[5]。为了更为深入地阐明miRNA的作用机制，miRNA的功能学研究是不可或缺的。miRNA抑制表达的功能学研究可以采用很多方法，主要包括运用体外合成的miRNA抑制物或构建相关抑制载体进行转染[6]。针对宫颈鳞癌SiHa细胞转染率低下的特点，本研究在以往实验的基础上构建了相关miRNA的慢病毒载体，为下一步载体的包装及假病毒颗粒的制备做好准备。慢病毒载体是体内体外基因转染的有力工具，该系统往往由3部分组成，即携带目的基因的载体质粒、提供病毒结构部件(gag/pol)质粒以及提供病毒衣壳的质粒构成[7]，其主要有以下优势：(1)慢病毒对分裂及非分裂细胞都具有极强大的转染能力；(2)慢病毒所携带的目的基因更能够耐受转录沉默；(3)由慢病毒介导的目的基因转染，可使目的基因整合到宿主染色体上随宿主细胞分裂而传给子代细胞，实现目的基因稳定而持久地表达[8]。本研究采用的GV280质粒，来源于人类免疫缺陷Ⅰ型病毒构件，所构建的载体中携带的目的基因在脑心肌炎病毒以及内部核糖体进入位点的下游，具有EGFP荧光蛋白基因，能为目的基因的表达提供可靠的保证[9]。miRNA过表达载体的构建可以采用miRNA的前体序列作为目的基因插入载体，也有研究采用的是包含miRNA前体序列两端的侧翼序列在内的核苷酸并经基因组DNA扩增后作为目的基因插入[10]。一般情况下当细胞内miRNA高水平表达时采用反义寡核苷酸抑制其活性来下调其表达水平是目前比较理想的功能丧失研究手段。

本实验成功构建了慢病毒miRNA抑制表达质粒GV280-miRNA-1246-down，具有极高的转染效果，几乎可以使100%的靶细胞SiHa获得目的基因，由于它带有GFP，可以通过荧光显微镜观察有无绿色荧光GFP来了解靶细胞是否被转导了目的基因，而无需繁琐的免疫组化或者PCR方法验证，简化了实验过程，目的基因可在2～3 d内转导入100%的靶细胞，达到稳定表达。为转基因的研究提供了快速、有效的工具，同时也为基因治疗提供了有力的依据。细胞增殖以及侵袭实验结果显示，miRNA-1246-down-LV组SiHa细胞增殖数低于其他两组(P<0.05)，细胞穿膜次数较其他两组减少(P<0.05)，提示miRNA-1246的下调可以抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖以及侵袭能力。这由于miRNA-1246是宫颈鳞状上皮癌的致癌基因，因此其表达下调可以明显抑制宫颈癌细胞的增殖以及侵袭。

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Construction of human microRNA-1246 inhibitor lentiviral vector and its influence on proliferation and invasion of cervical squamous carcinoma cells

LAIYue-hua,YAODe-sheng,DUPing,DUYan

(TheSecondWards,DepartmentofGynecologicOncology,theAffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To construct and identify human microRNA-1246 inhibitor lentiviral vector,and to explore the influence of miRNA-1246 down-regulation on the proliferation and invasion of cervical carcinoma cells.Methods The gene sequences of microRNA-1246-down antisense olignuclleotides were cloned into GV280 lentiviral vector using gene recombination technique.The successful construction of recombinant lentiviral vector(GV280-microRNA-1246-down) was identified by enzyme digestion,PCR and DNA sequencing.GV280-microRNA-1246-down，Helper1.0 and Helper2.0 were transfected into 293T cells together to get recombinant lentivirus.The virus fluid was concentrated and purified,and then viral titers were measured.The cervical squamous carcinoma SiHa cells were infected by recombinant virus fluid.The expression of GV280-microRNA-1246-down in SiHa cell was identified by detecting green fluorescent protein(GFP).The cell lines stably transfected by GV280-microRNA-1246-down were screened using puromycin.The SiHa cells were divided into blank group(NC group),negative virus group(NC-LV group) and microRNA-1246 down-regulation group(microRNA-1246-down-LV group).The proliferation rate of the cells was detected by cell counting,and the invasive ability of the cells was detected by Transwell assay.Results ① The corrected lentiviral vector was screened from the bacterial by PCR,and DNA sequencing proved that the inserted gene sequence was correct.② The target gene microRNA-1246-down was successfully induced into SiHa cell through lentivirus and expressed stably,the transfection rate was almost 100% .GFP was observed directly under fluorescence microscope.③ The microRNA-1246-down-LV group obtained less cell counts of SiHa proliferation and decreased cell invasion compared to other two groups(P<0.05).Conclusion The microRNA-1246 inhibitor lentiviral vector has been successfully constructed,and the SiHa cell lines stably transfected by microRNA-1246-down is established.Down-regulation of microRNA-1246 can inhibit the proliferation and invasion of cervical squamous carcinoma SiHa cells.

Cervical cancer,Lentivirus,MicroRNA,Inhibiton vector,Proliferation,Invasion

国家自然科学基金(8146039)；广西自然科学基金(2011GXNSFA018184；2015GXNSFAA139159)

赖月华(1987～)，女，硕士，住院医师，研究方向：妇科肿瘤学。

姚德生(1967～)，男，博士，主任医师，研究方向：妇科肿瘤学，E-mail：yaodeson@163.com。

R 737.33

A

0253-4304(2016)08-1053-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.08.01

2016-02-25

2016-05-05)