HBV相关性和非HBV相关性肝细胞癌组织的长链非编码RNA的表达分析

赵 冀 周 超 邓小凡 张 宇 刘兴超 朱世凯 陈 凯 陈云飞 杨洪吉

(四川省人民医院1 器官移植中心，2 消化内科，成都市 610072，E-maill：zhaoji8842@163.com)

论著·临床研究

HBV相关性和非HBV相关性肝细胞癌组织的长链非编码RNA的表达分析

赵 冀1周 超2邓小凡1张 宇1刘兴超1朱世凯1陈 凯1陈云飞1杨洪吉1

(四川省人民医院1 器官移植中心，2 消化内科，成都市 610072，E-maill：zhaoji8842@163.com)

目的 探讨HBV相关性和非HBV相关性肝细胞癌(HCC)组织的长链非编码RNA(lncRNA)的表达情况。方法 选择行手术治疗的HBV相关HCC患者42例、非HBV相关HCC患者45例，采用原位杂交技术检测两组患者肿瘤维修组和癌旁组织中肌动蛋白丝相关蛋白1-反义RNA1(AFAP1-AS1)、肝癌微血管浸润相关lncRNA(MVIH)和肺腺癌转移相关转录本1(MALAT-1)的表达水平，并比较不同临床特征HCC患者肿瘤组织AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1的表达情况。结果 在两组患者中，肿瘤组织AFAP-AS1的染色分数低于癌旁组织(P<0.05)，而肿瘤组织MVIH和MALAT-1的染色分数高于癌旁组织(P均<0.05)。HBV相关性HCC组癌旁组织中的AFAP-AS1染色分数高于非HBV相关HCC组癌旁组织(P<0.05)，而两组肿瘤组织AFAP-AS1染色分数、两组肿瘤组织或癌旁组织中MVIH和MALAT-1的染色分数比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。在HBV相关性HCC、非HBV相关性HCC患者中，AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1在不同的分期和分型患者的肿瘤组织中的表达水平比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 在HCC组织中AFAP1-AS1表达下调而MVIH和MALAT-1表达上调，三者均参与了HCC的发生发展，而AFAP1-AS1的表达可能还受到HBV相关生物学过程的调节。

肝细胞癌；乙型肝炎病毒；长链非编码RNA；肌动蛋白丝相关蛋白1-反义RNA1；肝癌微血管浸润相关长链非编码RNA；肺腺癌转移相关转录本1

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)全球的发病率和死亡率均较高，由于我国人口基数较大，在我国HCC的年新发病例数约占全球总新发病数的55%[1]。HCC的发生与HBV感染的关系十分密切，约50%的HCC是由HBV感染导致[1]。有研究表明HBV相关性HCC和非HBV相关性HCC可能存在临床病理特征的不同，前者的术后死亡风险是后者的1.5倍[2]。这些提示两种HCC的病理发展过程和疾病进展机制可能存在一定差异。一项大规模研究结果显示，约90%的HBV相关性HCC患者的肿瘤细胞里被整合进了HBV-DNA[3]，因此使得HBV相性关HCC的基因调控和蛋白表达也有异于非HBV相关性HCC，从而进一步使得两者的生物学过程表现不一致。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，二、三级结构复杂，在细胞凋亡、分化等生物学过程中发挥着重要作用[4]。越来越多的研究表明一些lncRNA在恶性肿瘤的发生发展中也扮演着重要角色，而在关于HCC的研究中，肌动蛋白丝相关蛋白1-反义RNA1(actin filament-associated protein 1-antisense RNA1，AFAP1-AS1)、肝癌微血管浸润相关lncRNA(long non-coding RNA associated with microvascular invasion in HCC， MVIH)和肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1)等lncRNA被发现在HCC组织中差异表达，并且部分lncRNA还与HCC的临床特征相关[5-7]。但这些lncRNA在HBV相关性HCC和非HBV性相关HCC中是否也存在差异表达，进而引起两者的生物学行为出现差异尚无明确结论。本研究旨在探讨HBV相关性HCC组织、非HBV相关性HCC组织和癌旁组织中AFAP1-AS1、MVIH、MALAT-1的表达情况，为揭示两种肿瘤不同生物学行为的表现机制提供参考。

1 资料和方法

1.1 临床资料 纳入2011年7月至2014年6月四川省人民医院器官移植中心收治的HCC患者。纳入标准：(1)病理学明确诊断为HCC；(2)符合卫生部发布的《原发性肝癌诊疗规范(2011年版)》[8]肝切除术适应证，并行手术治疗的患者，手术切除肿瘤组织和癌旁组织样本保存完好、可用；(3)术前同时接受血清HBV和HCV病毒标志物检测。排除标准：(1)外院手术者或无法获取肿瘤组织和癌旁组织样本者；(2)合并其他部位恶性肿瘤或其他器官严重功能障碍；(3)HBV和HCV同时感染者。最终纳入87例HCC患者，其中HBV相关性(HBsAg阳性)HCC 42例、非HBV相关性(HBsAg阴性)HCC 45例。两组患者临床资料比较，差异无统计学意义(P均>0.05)，见表1。所有受试者均签署知情同意书，本研究获得医院的伦理学委员会批准同意。

表1 两组临床资料比较

注：*按照肝细胞癌的巴塞罗那分期(2010版)进行临床分期[9]。

1.2 组织芯片制作 将42例HBV相关HCC和45例非HBV相关HCC的手术切除肿瘤组织、癌旁组织标本送西安艾丽娜生物科技有限公司加工制作，每张芯片包含175个组织点(每点都来源于不同患者或同一患者的不同类型组织)囊括了所有患者所有类型的组织和染色对照点，为保证后续实验顺利进行，共制作18张组织芯片，其中3张用作不同lncRNAs原位杂交实验条件摸索(每个lncRNA各1张)，9张用作检测(每个lncRNA各3张)，6张备用(每个lncRNA各2张)。

1.3 主要试剂与仪器 原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司、荧光倒置显微镜购自德国Leica公司(DM2500)、烘箱购自德国Binder公司、4℃和-20℃冰箱购自中国Haier公司。

1.4 原位杂交

1.4.1 寡核苷酸探针的设计和合成：在NCBI核酸数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中查找AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1相应基因的DNA序列，利用Primer5软件设计寡核苷酸探针，并在BLAST软件中进行精确匹配，并参阅相应文献[5-7]为每个lncRNA选出特异性较好、杂交参数最佳的探针。AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-13个lncRNA基因的探针序列分别为5′-TGTTGATTCTAAGAGGACACAGACTGCTTCATTC-3′、5′-CAAACAGGGAGTAGTTCTTAGTGAGTAGTTC-3′和5′-GAACATGTAACTTGTAGACTGGAGAAGATAGG-3′。最后送北京金唯智生物科技有限公司完成寡核苷酸探针的序列合成和标记(3′端采用地高辛标记)。

1.4.2 杂交检测：包含175个组织点的组织芯片经60 min烤片、30 min脱蜡、梯度酒精、灭火内源性过氧化物酶、暴露mRNA核酸片段、后固定等标准的流程处理后，进行预杂交(37℃ 4 h)、杂交(37℃过夜)、洗涤和封闭，再向芯片上滴加生物素化鼠抗地高辛、SABC和生物素化过氧化物酶等进行二氨基联苯胺染色，最后清洗封片。同一lncRNA的3张检测用芯片的处理条件保持一致。

1.5 结果判断 应用Leica荧光倒置显微镜观察AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1在各组织中的表达分布，并将图像拍照存档。采用半定量评分法[10]评价染色情况：(1)使用ImagePro Plus软件分析组织的平均光密度或阳性染色强度(阴性为0分、弱阳性为1分、阳性为2分、强阳性为3分)；(2)两名研究者分别对切片进行阳性染色细胞比率计分(0%～5%为0分、6%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、76%～100%为4分)；(3)染色分数=染色强度×阳性染色细胞比率计分。1.6 统计学分析 应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，不同组别样本间基因的表达差异比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1在不同类型HCC患者不同组织中的表达情况 AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1的表达主要定位于细胞质中。采用半定量评分法对三者的原位杂交染色结果进行评分，结果显示在HBV相关HCC组和非HBV相关HCC组中，肿瘤组织AFAP-AS1的染色分数低于癌旁组织(P均<0.05)，而肿瘤组织MVIH和MALAT-1的染色分数高于癌旁组织(P均<0.05)。HBV相关性HCC组癌旁组织中的AFAP-AS1染色分数高于在非HBV相关HCC组癌旁组织(P<0.05)，两组肿瘤组织AFAP-AS1染色分数、两组肿瘤组织或癌旁组织中MVIH和MALAT-1的染色分数比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表2。

表2 AFAP-AS1、MVIH和MALAT-1在两组不同组织中染色分数比较(x±s，分)

2.2 不同临床特征HCC患者肿瘤组织AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1的表达情况 在HBV相关性HCC、非HBV相关性HCC患者中，AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1在不同的分期和分型患者的肿瘤组织中的表达水平比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表3。

表3 不同临床特征HCC患者AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1的染色分数比较(x±s，分)

3 讨 论

基础研究表明，lncRNA作为基因组中的“暗物质”，实际上参与蛋白修饰过程、翻译水平、转录和表观遗传水平等多层面的生物学过程，并与肝癌、肺癌、结直肠癌等多种肿瘤的发生发展密切相关[11]。HCC作为一种与HBV感染密切相关的恶性肿瘤[12]，其基因组中lncRNA的表达调控可能受到HBV生物学过程的影响，从而使得lncRNA在肿瘤发生发展中的作用也发生改变。

肌动蛋白丝相关蛋白1基因本身被认为是病毒癌基因依赖的酪氨酸蛋白激酶的作用底物之一，有肌动蛋白衔接蛋白的功能，对维持上皮细胞张力丝的完整性十分重要，并且与前列腺癌和乳腺癌等密切相关。本研究结果显示，与癌旁组织相比，无论是HBV相关HCC还是非HBV相关HCC，其肿瘤组织中的AFAP-AS1表达均显著下调(P<0.05)，但不同临床分期和分型的HCC患者AFAP-AS1表达无明显差异(P>0.05)，提示AFAP-AS1在HCC发生中的潜在作用，但其与肿瘤的进展可能并无明显关系。赵艳华[5]也研究发现，AFAP1-AS1在HCC中的表达下调，并且可能通过RNA-RNA之间的相互作用影响肌动蛋白丝相关蛋白1生物学功能的发挥，从而达到参与HCC的发生发展中。此外，结果显示，AFAP1-AS1在HBV相关HCC癌旁组织中的表达显著高于非HBV相关HCC癌旁组织(P<0.05)，推测AFAP1-AS1的表达调控可能与HBV的生物学过程密切相关，AFAP1-AS1的下调可能与肿瘤的发生过程相关，因此AFAP1-AS1扮演的可能是抑制肿瘤发生的作用，但具体机制和信号转导通路还需进一步分析。

MVIH是一种与肿瘤微血管浸润相关的lncRNA[13]，袁声贤[6]对215例肝癌患者进行研究后证实了MVIH过表达与频繁的微血管浸润及较高的肿瘤淋巴结转移阶段，以及无复发生存率下降有关。本研究结果也显示，与癌旁组织相比，肿瘤组织中MVIH表达上调(P<0.05)，提示MVIH具有促进肿瘤发生的作用，符合前期研究[6]对MVIH潜在生物学功能的理解。MALAT-1是近些研究新发现的一个可作为肝移植后是否复发的独立预测指标[14]。有研究显示MALAT-1过表达广泛存在于HCC中，并参与HCC的增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为，是预测肝癌肝移植后肿瘤复发的独立危险因素[7，15]，本研究结果也显示肿瘤组织中MVIH表达上调(P<0.05)。但不同临床分期和分型的HCC患者MVIH、MALAT-1表达均无明显差异(P>0.05)，且两组肿瘤组织或癌旁组织中MVIH和MALAT-1的染色分数比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)，提示MVIH和MALAT-1与肿瘤的进展可能并无明显关系，且与HBV感染可能无相关性。

综上所述，AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-13种lncRNA与HCC的发生发展密切相关，其中AFAP1-AS1的表达调控可能与HBV的生物学过程密切相关，应深入分析lncRNA在HBV感染与HCC发生发展中的关系。但研究仍存在不足之处：一方面，本研究采用的是原位杂交方法，这种方法的稳定性不如实时荧光定量PCR，对条件的摸索和控制较为困难，因此外界因素可能对结果产生一定干扰；另一方面，本研究未结合患者的预后数据进行分析，因此对AFAP1-AS1、MVIH和MALAT-1等3种lncRNA在HCC进展中是否也具有重要作用不得而知。今后的研究还需采用更加准确的方法，全面地结合患者的临床病理特征，深入分析lncRNA在HBV相关HCC发生发展中的作用。

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Analysis on expressions of long non-coding RNAs in HBV-related and non-HBV-related hepatocellular carcinoma tissues

ZHAOJi1,ZHOUChao2,DENGXiao-fan1,ZHANGYu1,LIUXing-chao1,ZHUShi-kai1,CHENKai1,CHENYun-fei1,YANGHong-ji1

(1OrganTransplantCenter,2DepartmentofGastroenterology,SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu610072,China)

Objective To explore the expressions of long non-coding RNAs(lncRNA) in HBV-related and non-HBV-related hepatocellular carcinoma(HCC) tissues.Methods Forty-two patients with HBV-related and 45 with non-HBV-related HCC undergoing surgery were enrolled.insituhybridization technique was used to detect the expression levels of actin filament-associated protein 1-antisense RNA1(AFAP1-AS1),lncRNA associated with microvascular invasion in HCC(MVIH) and metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1(MALAT-1) in tumor tissues and paracarcinoma tissues of both groups.And the expressions of AFAP1-AS1,MVIH and MALAT-1 in the tumor tissues were compared between the HCC patients with different clinical features.Results In the two groups,the staining fraction of AFAP-AS1 was lower but the staining fractions of MVIH and MALAT-1 were higher in the tumor tissues compared to the paracarcinoma tissues(allP<0.05).The staining fraction of AFAP-AS1 in the paracarcinoma tissues of HBV- related HCC group was higher than that in the paracarcinoma tissue of non-HBV-related HCC(P<0.05),but no significant difference in the staining fraction of AFAP-AS1 in the tumor tissues was found between the two groups(allP>0.05).And there were no significant differences in the staining fractions of MVIH and MALAT-1 in either tumor tissues or paracarcinama tissues between the two groups(allP>0.05).For the patients with HBV-related HCC or non-HBV-related HCC,no significant differences in the staining fractions of AFAP-AS1,MVIH and MALAT-1 in the tumor tissues were found between the patients with different stages or classifications(allP>0.05).Conclusion The expression of AFAP1-AS1 decreases but the expressions of MVIH and MALAT1 increase in HCC tissues,and all of them are involved in the development of HCC.And the expression of AFAP1-AS1 may also be regulated by HBV-related biological processes.

Hepatocellular carcinoma,Hepatitis B virus,Long non-coding RNA,Actin filament-associated protein1-antisense RNA1,Long non-coding RNA associated with microvascular invasion in HCC,Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1

赵冀(1980～)，男，博士，主治医师，研究方向：肝癌诊断治疗基础与临床。

R 735.7

A

0253-4304(2016)10-1385-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.13

2016-04-27

2016-07-19)