脑脊液细菌16S核糖体RNA基因检测在抗生素治疗后化脓性脑膜炎患儿中的应用价值▲

郑可鲁 杨思达 高媛媛 陈文雄 黄怡玲 张雅妮

(广州市妇女儿童医疗中心儿童神经内科，广州市 510623，E-mail：zhao86453@163.com)

论著·临床研究

脑脊液细菌16S核糖体RNA基因检测在抗生素治疗后化脓性脑膜炎患儿中的应用价值▲

郑可鲁 杨思达 高媛媛 陈文雄 黄怡玲 张雅妮

(广州市妇女儿童医疗中心儿童神经内科，广州市 510623，E-mail：zhao86453@163.com)

目的 探讨脑脊液细菌16S 核糖体RNA(16S rRNA)基因检测在抗生素治疗后化脓性脑膜炎患儿中的应用价值。方法 选择化脓性脑膜炎患儿60例，在抗生素使用早期及后期采集脑脊液标本，同时进行16S rRNA基因检测及细菌培养，比较两种方法的检测阳性率，分析抗生素应用时间对两种检测方法结果的影响。结果 脑脊液16S rRNA基因检测阳性21例(35.0%)，脑脊液细菌培养阳性9例(15.0%)，16S rRNA基因检测阳性率高于细菌培养(P<0.05)。抗生素应用早期16S rRNA基因检测阳性率略高于抗生素应用后期，但差异无统计学意义(P>0.05)；抗生素应用早期脑脊液细菌培养检测阳性率高于抗生素应用后期(P<0.05)。结论 对于抗生素治疗后化脓性脑膜炎患儿，脑脊液16S rRNA基因检出阳性率高于脑脊液细菌培养，且可能更少受抗生素应用时间的影响。

化脓性脑膜炎；抗生素；脑脊液；16S 核糖体RNA；细菌培养；基因检测

化脓性脑膜炎是一种小儿常见的疾病，其发病急，若不及时治疗，患儿会出现严重后遗症，严重者甚至死亡[1-2]。近年来，由于抗生素广泛使用，儿童化脓性脑膜炎的临床表现趋于不典型，诊断难度加大。传统脑脊液细菌培养多需要48 h以上，药物敏感试验结果则需要72 h，且培养阳性率不高，极大限制了脑脊液细菌培养的应用[3-4]。抗生素治疗后期，脑脊液细菌培养阴性，而脑脊液常规和生化检测却持续异常，导致停用抗生素缺乏足够依据。过早停药会增加病情迁延、复发的概率；长时间用药则增加患儿痛苦及其家庭的经济负担，且易致耐药菌产生，不符合抗生素使用原则[5-6]。本研究以60例小儿化脓性脑膜炎患儿为研究对象，对患儿脑脊液进行16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA，16S rRNA)基因检测分析，并与脑脊液细菌检测结果进行比较，分析抗生素应用时间对脑脊液细菌16S rRNA基因检测的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2014年2月至2016年3月在我院就诊的化脓性脑膜炎患儿60例，其中男40例、女20例，年龄0.1～13岁，平均年龄6.5岁，病程3～7 d。诊断标准参考《实用新生儿学》中的相关诊断标准[7]：(1)体温异常，精神差，拒奶，惊厥或有败血症的表现；(2)颅内压增高，前囱隆起，骨缝裂开，脑膜刺激征阳性；(3)脑脊液：白细胞>20×106/L，葡萄糖降低，蛋白质升高；(4)脑脊液细菌培养阳性或涂片上可见细菌。符合(1)～(3)条可临床诊断，具备(4)可确诊。所有患儿均确诊患有化脓性脑膜炎。本研究经我院伦理委员会同意，患儿家属签署知情同意书。

1.2 治疗方法 根据患儿的细菌培养结果，使用青霉素、头孢唑肟等相应敏感抗生素治疗。对于病情较重患儿辅以高压氧治疗。根据患儿实际情况进行电解质平衡维持、丙种球蛋白支持以及甘露醇、地塞米松等对症治疗。

1.3 脑脊液检测 抗生素治疗<3 d为早期，治疗后4 d至2周为后期；如脑脊液常规、生化2周仍明显异常者，于抗生素治疗4周第3次留取脑脊液做为后期标本。分别在抗生素应用早期、后期，通过严格无菌操作腰椎穿刺获取组中患儿脑脊液标本，每位患儿标本分为两份各2 ml，同时采用以下两种方法进行检测。

1.3.1 16S rRNA基因检测：应用16S rRNA宽范围PCR扩增技术，对化脓性脑膜炎患儿脑脊液标本中细菌基因组 DNA扩增，并将PCR阳性产物测序，明确细菌菌种。主要试剂与仪器包括：DNA提取试剂(广州东盛生物科技有限公司)、PCR反应试剂盒(广州东盛生物科技有限公司)、9600型PCR分析仪(美国ABI公司)。主要步骤如下：(1) 16S rRNA宽范围PCR扩增法：取2 ml脑脊液离心后沉淀以500 μl TE缓冲液悬浮，经溶菌酶、蛋白酶K孵育，用酚-氯仿法提取脑脊液中DNA。对照菌株经LB培养基增菌后取2 ml，通过以上方法提取脑脊液标本中细菌DNA。采用宽范围 PCR 扩增，PCR反应条件为：95℃预变性5 min，然后95℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。每次扩增临床标本时均包含阳性对照和阴性对照，阳性对照为金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌标准菌株，阴性对照为PCR体系中不加模板DNA。(2)在GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)中应用BLAST检索工具对所有阳性PCR产物进行序列对比，从而确立菌名。在GenBank中比对结果同源性超过 98%才能确立为同一种属。

1.3.2 普通细菌培养：(1)脑脊液标本接种于美国BacT/ALERT的儿童专用树脂培养瓶(美国 bioMerieux公司)中，放置BACTEC 9120全自动培养箱(北京普博斯生物科技有限公司)中培养。 (2)阳性报警后移种血、流感嗜血杆菌XV琼脂平皿，培养18～24 h，分离菌株。(3)采用临床实验室标准委员会制订的标准进行判断和药敏试验[8]。

1.4 统计学分析 应用SPSS 18.0进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两种检测方法的检测结果比较 60例化脓性脑膜炎患儿中，脑脊液16S rRNA基因检测阳性21例，其中金黄色葡萄球菌4例，大肠埃希菌4例，肺炎链球菌3例，无乳链球菌3例，脑膜炎球菌3例，流感嗜血杆菌3例，脆弱拟杆菌1例。脑脊液细菌培养阳性9例，其中金黄色葡萄球菌3例，大肠埃希菌2例，脑膜炎球菌2例，流感嗜血杆菌1例，肺炎链球菌1例。16S rRNA基因检测阳性率为35.0%(21/60)，高于细菌培养的15.0%(9/60)，差异有统计学意义(χ2=6.400，P=0.011)。

2.2 抗生素应用时间对脑脊液细菌16S rRNA基因检测及细菌培养影响 抗生素应用早期16S rRNA基因检测阳性率略高于抗生素应用后期，但差异无统计学意义(P>0.05)；抗生素应用早期脑脊液细菌培养阳性率高于抗生素应用后期(P<0.05)。见表1。

表1 不同抗生素应用时期两组检测结果比较(n，%)

3 讨 论

小儿化脓性脑膜炎是指由化脓性细菌感染导致患儿中枢神经感染的炎症。近年来，抗生素的不规范使用，导致患儿化脓性脑膜炎早期临床表现不明显，脑脊液检测结果不稳定，如不及时治疗会导致患儿出现一系列后遗症，严重者会有生命危险[9]。因此，探讨小儿化脓性脑膜炎抗生素应用时间对脑脊液细菌16S rRNA基因检测的影响，为小儿化脓性脑膜炎早期确诊提供参考，有重要的意义。

16S rRNA基因是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中，但不存在于病毒、真菌等非原核生物体内[10-11]。它具有多拷贝、多信息、长度适中等特点，集保守性与变异性于一身，既能反映不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列[8，12]。应用16S rRNA宽范围PCR扩增技术，可在抗生素应用早、后期对化脓性脑膜炎患儿脑脊液中细菌基因组DNA进行扩增，并将PCR阳性产物测序，明确细菌菌种。而传统的脑脊液细菌培养检测，由于还没有专门的检测仪器完成对脑脊液自动判断，只能通过人工镜像检测观察的方法对脑脊液细胞分析，同时采用生化分析仪完成对脑脊液中葡萄糖、蛋白质进行简单分析，这些方法受人为因素影响较大，检测可靠性得不到保证[13]。此外，由于患者多为婴儿，脑脊液总量少，难以足量留取标本量以提高培养阳性率，亦对脑脊液细菌培养影响较大。本研究结果显示，患者中16S rRNA基因检测阳性21例(35.0%)，脑脊液细菌培养阳性仅9例(15.0%)，16S rRNA基因检出阳性率显著高于脑脊液细菌培养(P<0.05)。

本研究结果显示，抗生素应用早期16S rRNA基因检测阳性率为36.67%，略高于应用抗生素后期，但差异无统计学意义(P>0.05)，而抗生素应用早期脑脊液细菌培养检测阳性率显著高于应用抗生素后期(P<0.05)，提示与脑脊液细菌培养比较，脑脊液16S rRNA基因检测可能更少受抗生素应用时间的影响。这是由于脑脊液细菌16S rRNA基因检测不受脑脊液中细菌增殖分裂的影响，即使脑脊液中细菌浓度较低，也能获得较好的检测结果。这表明即使在服用抗生素治疗后期，脑脊液16S rRNA基因检测亦能得到准确的检测结果，为停用抗生素提供有力判断依据，避免抗生素的滥用及病情的迁延与反复。

综上所述，在抗生素治疗化脓性脑膜炎患儿中，进行脑脊液16S rRNA基因检测较传统细菌培养法具有较高的阳性率，且在抗生素应用早期及后期的检出阳性率差异不大。这有助于提高对化脓性脑膜炎患儿的早期诊断能力，并为临床医师及时、合理地使用抗生素治疗提供依据。

[1] 胡月圆,高喜容,占彩霞,等.新生儿不同病原菌化脓性脑膜炎临床分析[J].临床儿科杂志,2015,33(1):13-16.

[2] 蓝明平,蒋 莉.婴儿化脓性脑膜炎并发硬膜下积液的早期诊断[J].重庆医科大学学报,2015,40(1):82-87.

[3] 汤海燕,谈 鹰,张 栗.脑脊液与血浆生化指标比值对结核性脑膜炎与化脓性脑膜炎的鉴别意义[J].中国全科医学,2015,18(14):1 705-1 707,1 710.

[4] Kamoun F,Dowlut MB,Ameur SB,et al.Neonatal purulent meningitis in southern Tunisia:Epidemiology,bacteriology,risk factors and prognosis[J].Fetal Pediatr Pathol,2015,34(4):233-240.

[5] 陈 丽,吴本清,程涵蓉,等.新生儿B族链球菌败血症合并化脓性脑膜炎五例临床分析[J].中国全科医学,2013,16(23):2 750-2 752.

[6] 陈 洁,李 芹.无乳链球菌感染致新生儿化脓性脑膜炎并硬膜下积液1例报告[J].临床儿科杂志,2014,32(7):658-659.

[7] 金汉珍.实用新生儿学[M].第3版.北京:人民卫生出版社,2003:349.

[8] 倪语星,王金良.抗微生物药物敏感性试验规范[M].第2版.上海:上海科技出版社,2009:1-109.

[9] Liu AC,Wang C,Liang Z,et al.High-throughput sequencing of 16S rDNA amplicons characterizes bacterial composition in cerebrospinal fluid samples from patients with purulent meningitis[J].Drug Des Devel Ther,2015,9:4 417-4 429.

[10]杨祖钦,尚世强,吴亦栋,等.脑脊液细菌16S rRNA荧光定量聚合酶链反应快速诊断儿童化脓性脑膜炎[J].中华传染病杂志,2006,24(5):342-344.

[11]舒小莉,吴亦栋,尚世强.细菌16S rRNA基因实时荧光定量及分型方法的建立[J].中国当代儿科杂志,2008,10(6):732-736.

[12]喻长法,张仙森,任应鹏,等.16S rRNA基因检测在儿童化脓性脑膜炎早期诊断中的研究[J].中国优生与遗传杂志,2009,17(6):17-18.

[13]Qian Y,Wong CC,Lai SC,et al.Klebsiella pneumoniae invasive liver abscess syndrome with purulent meningitis and septic shock:A case from mainland China[J].World J Gastroenterol,2016,22(9):2 861-2 866.

Application value of cerebrospinal fluid bacterial 16S ribosomal RNA gene detection in children with purulent meningitis after antibiotic therapy

ZHENGKe-lu,YANGSi-da,GAOYuan-yuan,CHENWen-xiong,HUANGYi-ling,ZHANGYa-ni

(DepartmentofPediatricNeurology,GuangzhouWomenandChildrenMedicalCenter,Guangzhou510623,China)

Objective To investigate the application value of cerebrospinal fluid(CSF) bacterial 16S ribosomal RNA(16S rRNA) gene detection in children with purulent meningitis after antibiotic therapy.Methods Sixty children with purulent meningitis were enrolled.The CSF specimens were collected during the early and late stages of antibiotic therapy,and used for 16S rRNA gene detection and at the bacterial culture.The detection positive rates were compared between the two methods,and the effect of antibiotic application time on the results of the two methods was analyzed.Results Twenty-one(35.0%) and 9(15.0%) positive cases were observed in CSF 16S rRNA gene detection and CSF bacterial culture respectively.The detection positive rate of 16S rRNA gene detection was higher than that of bacterial culture(P<0.05).For 16S rRNA gene detection,the detection positive rate during the early stage of antibiotic therapy was higher than that during the late stage,but no statistical difference was observed(P>0.05).For CSF bacterial culture,the detection positive rate during the early stage of antibiotic therapy was significantly higher than that during the late stage(P<0.05).Conclusion For the children with purulent meningitis after antibiotic therapy,the detection positive rate of CSF 16S rRNA gene detection is higher and is less affected by the application time of antibiotics compared to the rate of CSF bacterial culture.

Purulent meningitis,Antibiotics,Cerebrospinal fluid,16S ribosomal RNA,Bacterial culture,Gene detection

广东省广州市卫生局课题(20151A010050)

郑可鲁(1979～)，男，本科，主治医师，研究方向：神经内科。

R 512.3

A

0253-4304(2016)10-1367-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.08

2016-05-15

2016-07-18)