鼻咽癌复发患者EB病毒DNA及抗体的表达情况及其临床意义▲

翁敬锦 司勇锋 邓卓霞 覃扬达 韦嘉章 宁乐平 陆锦龙 江 河 韩 星

(1 广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈肿瘤科、鼻咽癌研究所，南宁市 530021，E-mail：wengjingjin@163.com；2 广西医科大学研究生学院，南宁市 530021；3 广西壮族自治区人民医院检验科，南宁市 530021)

论著·临床研究

鼻咽癌复发患者EB病毒DNA及抗体的表达情况及其临床意义▲

翁敬锦1，2司勇锋1邓卓霞1覃扬达1韦嘉章1宁乐平3陆锦龙1江 河1韩 星1

(1 广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈肿瘤科、鼻咽癌研究所，南宁市 530021，E-mail：wengjingjin@163.com；2 广西医科大学研究生学院，南宁市 530021；3 广西壮族自治区人民医院检验科，南宁市 530021)

目的 探讨鼻咽癌复发患者治疗前后EB病毒(EBV)-DNA、病毒衣壳蛋白抗原-IgA(VCA-IgA)和早期抗原-IgA(EA-IgA)的表达情况及其临床意义。方法 选择鼻咽癌复发患者124例为复发组，其中手术组77例，采用鼻内镜手术或鼻内镜手术联合放、化疗；放化疗组47例，采用放疗和(或)化疗。另选取30例鼻咽癌治疗后放射性颅底骨坏死患者(无复发)为对照组。在治疗前及治疗结束时，检测所有患者血清VCA-IgA、EA-IgA、EBV-DNA阳性表达情况。结果 治疗前，复发组、对照组EBV-DNA阳性率分别为51.61%、0，两组VCA-IgA和EA-IgA阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗前，局部、颈部、局部及颈部复发的鼻咽癌患者间EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期复发鼻咽癌患者中，EBV-DNA阳性率随临床分期增高而增高(P<0.05)，但VCA-IgA及EA-IgA阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗前，手术组与放化疗组EBV-DNA、VCA-IgA、EA-IgA阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后，手术组EBV-DNA转阴率高于放化疗组(P<0.05)，且手术组EBV-DNA阳性率低于放化疗组(P<0.05)，但两组VCA-IgA及EA-IgA阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 检测EBV-DNA可能有助于判断鼻咽癌复发和分期，手术治疗有助于清除机体的EBV。但在鼻咽癌治疗后放射性颅底骨坏死患者中仍可检出VCA-IgA、EA-IgA，建议对患者的抗体水平进行动态观察。

鼻咽肿瘤；EB病毒；DNA；病毒衣壳蛋白抗原-IgA；早期抗原-IgA；手术；放射治疗；化学治疗

鼻咽癌是我国南方地区常见的恶性肿瘤之一。由于对放射线敏感，放射治疗是初治鼻咽癌治疗的主要手段。放疗后失败的主要原因包括复发和远处转移，复发率约为10%[1]。由于首程放疗后鼻咽部纤维化增生、血供较差、乏氧细胞增多等原因，单纯再程放疗疗效不佳。已有研究证实手术在治疗残留和复发鼻咽癌中具有重要作用[2]。由于鼻咽部解剖结构复杂，以往常常通过上颌骨切开外旋切除复发病灶；随着鼻内镜技术的发展，目前不少机构开展了鼻内镜手术切除鼻咽癌复发病灶并取得较好的疗效[3-4]。相关研究证实EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)-DNA水平是监测复发鼻咽癌患者疗效的有效指标[5]。目前，有关复发鼻咽癌患者鼻内镜手术前后EB病毒DNA和EB病毒抗体水平的研究报道罕见。本研究通过检测复发鼻咽癌患者治疗前后血浆EBV-DNA水平及血清病毒衣壳蛋白抗原-IgA(viral capsid antigen-IgA，VCA-IgA)和早期抗原-IgA(early antigen-IgA，EA-IgA)水平，探讨其变化特点及其与临床指标的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年1月至2016年1月在我院治疗的鼻咽癌复发患者。纳入标准：(1)我院确诊复发并且无远处转移鼻咽癌，未经治疗的患者；(2)距离首程末次放疗结束日3个月以上；(3)有可测量及评价疗效的病灶；(4)卡氏评分≥70分；(5)患者同意对治疗后复发病灶再治疗，包括手术和(或)放化疗，并在知情同意书上签字。共纳入124例(复发组)，男95例，女29例，年龄22～70岁，中位年龄49岁；均经组织病理检查确诊。其中手术组77例，采用鼻内镜手术或鼻内镜手术联合放、化疗；放化疗组47例，采用放和(或)化疗。两组病例的性别、年龄、T分期、N分期、临床分期比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。选择同期30例鼻咽癌治疗后放射性颅底骨坏死患者(无复发)作为对照组，其中男25例，女5例，年龄20～69岁，中位年龄55岁，与复发组比较，两组的性别和年龄差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 手术组和放化疗组的临床资料比较(n，%)

1.2 复发鼻咽癌的治疗方法 (1)手术：全麻成功后，使用肾上腺素棉片收缩鼻腔黏膜3次，使用0度鼻内镜常规切除鼻中隔后1/3，沿肿瘤周边正常黏膜切开，通常切除深度达颅底骨质，依据肿瘤的位置及侵犯情况做相应范围切除。(2)放疗：采用调强放疗，依据MRI显示的肿瘤影像边界勾画靶区，其中肿瘤靶区(gross tumor volume，GTV)2.0～2.2 Gy/次，计划靶区(planning target volume，PTV)1.8～2.0 Gy/次，5 d/周，GTV总剂量为50～60 Gy，PTV为45～60 Gy。(3)化疗：TP(紫杉醇+顺铂)或者PF(顺铂+氟尿嘧啶)方案化疗2～4周期。TP方案：多西紫杉醇75 mg/m2，第1天使用，静脉滴注60 min；顺铂30 mg/m2，第1～3天使用，静脉滴注，每21 d为1周期；PF方案：顺铂30 mg/m2，于第1～3天静脉滴注；氟尿嘧啶2 000 mg/m2，持续120 h泵入，每21 d为1周期。

1.3 标本收集 所有患者于治疗前及出院当天分别取肘静脉血2.0 ml，分别置于1个乙二胺四乙酸抗凝管和1个促凝管中；其中抗凝管以3 000 r/min离心5 min后分离上层血浆，用于提取DNA，促凝管以3 000 r/min离心5 min后分离血清，-20℃下保存待测。

1.4 检测仪器 采用瑞士Tecan公司Freedom EVO® 酶联免疫吸附测定(ELISA)酶标仪和Roche公司的LightCycler®480荧光定量PCR仪。

1.5 检测方法 (1)分别使用北京新兴四寰生物技术有限公司(批号：201508002)和欧蒙医学实验诊断股份公司(批号：E150924AS)提供的ELISA试剂盒测定VCA-IgA和EA-IgA，按试剂说明书操作规程进行操作，用酶标仪定性检测，得吸光度值(A值)。结果判断：VCA-IgA比值>1.0判定为阳性，EA-IgA比值>1.1判定为阳性。(2)荧光定量PCR测定EBV-DNA水平：试剂盒由中山大学达安基因诊断中心提供(编号：Cat.#DA-D065)，所扩增的目的基因来自EB病毒的BamHI-W片段，按说明书操作规程进行操作。结果判断：扩增结果>0 copy/ml判定为阳性。

1.6 统计学分析 应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计数资料组间比较采用χ2检验或确切概率法，趋势变化分析采用χ2趋势检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 复发组和对照组治疗前EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA阳性率比较 复发组鼻咽癌患者血浆EBV-DNA阳性率为51.61%，而对照组无EBV-DNA阳性患者，复发组EBV-DNA阳性率高于对照组(P<0.05)；两组VCA-IgA和EA-IgA阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 复发组和对照组的治疗前EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA阳性率比较

注：*采用确切概率法。

2.2 不同复发类型鼻咽癌患者治疗前EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA阳性率比较 不同复发类型其EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 不同复发类型鼻咽癌患者EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA阳性率比较

2.3 复发鼻咽癌患者治疗前EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA与临床分期的关系 在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期患者中，治疗前EBV-DNA阳性率随复发鼻咽癌临床分期增高而增高(P<0.05)；不同临床分期患者VCA-IgA及EA-IgA阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 不同分期鼻咽癌患者EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA阳性率比较

注：*采用χ2趋势检验。

2.4 不同治疗方案组治疗前后EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA的动态变化 治疗前，手术组与放化疗组EBV-DNA、VCA-IgA、EA-IgA阳性率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表5。手术组38例EBV-DNA阳性患者中，术后转阴35例(92.11%)，放化疗组26例EBV-DNA阳性患者中，放化疗后转阴18例(69.23%)，手术组EBV-DNA转阴率高于放化疗组(χ2=4.182，P<0.05)。治疗结束时，手术组EBV-DNA阳性率低于放化疗组(P<0.05)，但两组VCA-IgA及EA-IgA阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表6。

表5 不同治疗方案组治疗前EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA比较

表6 不同治疗方案组治疗后EBV-DNA、VCA-IgA和EA-IgA比较

3 讨 论

鼻咽癌是我国广西和广东地区常见的恶性肿瘤。鼻咽癌的病因学研究表明，EB病毒可导致鼻咽部上皮细胞永生化，从而进一步使其发生恶变[6]。在鼻咽癌高发区，大部分患者的病理类型为未分化非角化性癌(WHO Ⅲ型)，其与EB病毒感染有关，约70%的患者EB病毒抗体阳性[7]。目前有关鼻咽癌的临床诊断研究较多且较肯定的EBV抗原主要有VCA和EA。EBV VCA-IgA抗体可出现于鼻咽癌确诊前，持续监测VCA-IgA有助于发现早期鼻咽癌[8]。有研究证实，EA-IgA的出现为机体EBV复制的标志之一，在鼻咽癌中有着较高的特异性[9]。在初治鼻咽癌中，EBV-DNA与肿瘤的分期、体积以及预后均有关。已有研究证实，首诊鼻咽癌治疗结束时通常检测不到EBV-DNA，如患者血液中检测到EBV-DNA，通常提示残留或复发[10]。本研究结果也显示，鼻咽癌复发患者的EBV-DNA阳性率为51.61%，而无复发的鼻咽癌放射性颅底骨坏死患者中无1例检出EBV-DNA。本研究中，无复发的鼻咽癌颅底骨坏死患者EA-IgA阳性率为30.00%，而VCA-IgA则高达56.67%，提示鼻咽癌治疗后部分无复发和转移患者仍可检测到VCA-IgA和EA-IgA，因此尚不能得出监测VCA-IgA和EA-IgA有助于发现复发鼻咽癌的结论。但有学者发现持续高水平的抗体水平被认为与复发和转移有关[11]，而本研究仅从VCA-IgA和EA-IgA的阳性率进行比较，依据既往学者的研究结果，我们建议对患者的抗体水平进行动态观察，推荐联合EBV-DNA与VCA-IgA及EA-IgA检测，可能有助于提高复发鼻咽癌的检出率。

本文结果显示，治疗前EBV-DNA阳性率随复发鼻咽癌临床分期增高而增高(P<0.05)，而其他学者也认为EBV-DNA水平与患者临床分期有关[12]，这均提示检测EBV-DNA可能有助于临床分期的判断。有学者发现颈部复发的鼻咽癌患者的EBV-DNA载量水平高于局部复发患者[13]，认为这与颈部复发灶其肿瘤负荷大于局部复发灶有关。而目前鲜有有关局部和颈部均复发的鼻咽癌患者EBV-DNA水平的研究报道，这可能与这类疾病发生率较低有关。本研究结果显示，局部和颈部均复发患者EBV-DNA阳性率与颈部复发患者相当，并均高于局部复发，但3者差异无统计学意义(P>0.05)。由于临床分期由局部分期、颈部分期以及远处分期构成，本研究虽然收集了3类复发患者，但后两者例数偏少，因此目前尚不能得出颈部复发患者其EBV-DNA阳性率高于局部复发患者。

由于二程放疗患者对放射线抗拒，目前通常认为复发患者首选手术治疗，患者采用手术为主的综合治疗其预后优于采用非手术治疗[3]。对于可切除病灶而言，手术的优点在于一次性完全消除所见肿瘤。有研究表明血液中的EBV主要来源于肿瘤细胞[10，14]。通常认为血浆中EBV水平与肿瘤细胞产生量和血液循环清除率有关，手术切除肿瘤后机体EBV-DNA水平迅速下降，中位清除时间为139 min[15]。有学者发现，治疗前EBV-DNA高水平的患者预后差[5]，但另有学者认为EBV-DNA的清除率才是预后的独立危险因素[14]。本研究中，治疗前手术组和放化疗组EBV-DNA阳性率无差异(P>0.05)，治疗后，手术组EBV-DNA转阴率高于放化疗组(P<0.05)，且手术组EBV-DNA阳性率明显低于放化疗组(P<0.05)。此外，在本研究中，手术组不仅纳入了早、中期复发鼻咽癌患者，还包括了22例Ⅳ期复发鼻咽癌患者。以往认为T3和rN3手术难于完全切除，最近中山大学肿瘤防治中心及我们的前期研究结果均表明上述患者仍可手术治疗[16-17]。这进一步提示手术治疗较放化疗更有助于清除机体的EBV，减少EBV再激活的概率，推断这可能是其疗效优于常规放化疗的原因之一。至于EBV-DNA可否为影响预后的独立危险因素，则有待进一步生存分析研究以证实。

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参 考 文 献

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Expression of Epstein-Barr virus DNA and antibody in patients with recurrent nasopharyngeal carcinoma and its clinical significance

WENGJing-jin1,2,SIYong-feng1,DENGZhuo-xia1,QINYang-da1,WEIJia-zhang1,NINGLe-ping3,LUJin-long1,JIANGHe1,HANXing1

(1DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckOncology&InstituteofNasopharyngealCarcinomaResearch,thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China;2GraduateSchool,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;3DepartmentofLaboratory,thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning530021,China)

Objective To explore the expressions of Epstein-Barr virus(EBV)-DNA,viral capsid antigen-IgA(VCA-IgA) and early antigen-IgA (EA-IgA) in patients with recurrent nasopharyngeal carcinoma(NPC) before and after treatment,and its clinical significance.Methods A total of 124 patients with recurrent NPC were enrolled as recurrent group,including 77 cases treated with nasal endoscopic surgery or nasal endoscopic surgery combined with chemoradiotherapy(surgery group) and 47 cases treated with radiotherapy or chemotherapy(radiochemotherapy group).And 30 non-recurrent NPC patients with skull base osteoradionecrosis(ORN) after radiotherapy were enrolled as control group.Before and after treatment,the positive expressions of serum VCA-IgA,EA-IgA and EBV-DNA were detected.Results Before treatment,the positive rates of EBV-DNA in the recurrent group and control group were 51.61% and 0 respectively,and there were no statistical differences in the positive rates of VCA-IgA and EA-IgA between the two groups(P>0.05).No significant differences in the positive rates of EBV-DNA,VCA-IgA and EA-IgA were observed among the NPC patients with local recurrence,neck recurrence and local and neck recurrence before treatment(P>0.05).Among the recurrent NPC patients with stage Ⅰ,stage Ⅱ,stage Ⅲ and stage Ⅳ,the positive rate of EBV-DNA increased with the increase of clinical staging(P<0.05),but no statistical differences in the positive rates of VCA-IgA and EA-IgA were observed(P>0.05).Before treatment,there were no statistical differences in the positive rates of EBV-DNA,VCA-IgA and EA-IgA between the surgery group and the chemoradiotherapy group(P>0.05).After treatment,the seroconversion rate of EBV-DNA was higher and the positive rate of EBV-DNA was lower in the surgery group compared to the chemoradiotherapy group(P<0.05),but there were no statistical differences in the positive rates of VCA-IgA and EA-IgA between the two groups(P>0.05).Conclusion The detection of EBV-DNA may be helpful for assessing the recurrence and staging of NPC,and surgical treatment may be helpful for the removal of EBV.But VCA-IgA and EA-IgA remain detectable in NPC patients with ORN after radiotherapy,therefore,it is suggested that dynamic observation on the levels of antibodies should be performed among patients. 【Key words】 Nasopharyngeal tumor,Epstein-Barr virus,DNA,Viral capsid antigen-IgA,Early antigen-IgA,Surgery,Radiotherapy,Chemotherapy

广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻1355005-3-9)；广西医药卫生科研课题(Z2013402)

翁敬锦(1983～)，男，硕士，主治医师，研究方向：鼻咽癌的基础和临床研究。

司勇锋(1957～)，男，本科，主任医师，研究方向：鼻咽癌的基础和临床研究，E-mail：syfklxf@126.com。

R 739.63

A

0253-4304(2016)10-1355-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.05

2016-04-21

2016-07-16)