南蛇藤提取物对过表达mTOR的人肝癌HepG2细胞株的影响＊

钱亚云，陆松花，赵雪煜，杨 婷，史有阳，金 凤，刘延庆

（扬州大学医学院 扬州 225009）

南蛇藤提取物对过表达mTOR的人肝癌HepG2细胞株的影响＊

钱亚云＊＊，陆松花，赵雪煜，杨 婷，史有阳，金 凤，刘延庆

（扬州大学医学院 扬州 225009）

目的：构建过表达雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）的人肝癌HepG2细胞，并研究中草药南蛇藤Celastrus orbiculatus Thunb.提取物对该细胞的影响。方法：利用分子生物学技术，将GV238-mTOR重组质粒转染人肝癌HepG2细胞，分别用荧光素酶活性检测和Western Blot实验，分析转染后的细胞中mTOR的表达水平。人肝癌HepG2/mTOR++细胞中，加入不同浓度的南蛇藤提取物（20、40、80、160、320 μg·mL-1）作用24 h后，分析南蛇藤提取物对mTOR蛋白的作用。结果：经转染的人肝癌HepG2细胞中，mTOR蛋白的表达水平显著增加。南蛇藤提取物明显抑制肝癌细胞的增殖，并明显降低细胞内mTOR蛋白的表达。结论：本实验成功获得能稳定过表达mTOR的人肝癌HepG2细胞株。南蛇藤提取物明显抑制肝癌细胞内mTOR蛋白的表达水平。

南蛇藤 肝癌 过表达 雷帕霉素靶蛋白

哺乳动物mTOR也称雷帕霉素相关蛋白（Rapamycin-Associated Protein, FKBP），是磷脂酰肌醇激酶相关激酶蛋白家族成员，属非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究发现mTOR参与体内多条信号通路的调节，在细胞的增殖、分化、自噬等环节具有中心调控作用[1]。临床肝癌手术标本中mTOR的表达量与肝癌的恶性程度及不良转归呈正相关[2]。这些结果提示mTOR可能是药物治疗肝癌的潜在靶点之一。为了研究mTOR在肝癌中的作用，本课题组构建了能稳定过表达mTOR的人肝癌HepG2细胞，并研究了中草药南蛇藤提取物对该细胞株的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

人肝癌细胞株HepG2，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。带有荧光素酶报告基因的载体GV238（元件顺序MCS-Luc），本实验室自备。限制性内切酶MluI和BglII、T4 DNA Ligation Kit购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司。梭华-Sofast基因转染盒购自厦门太阳马生物工程有限公司。

1.2 药物

南蛇藤提取物提取方法如前所述[5,6]，现简述如下。南蛇藤购自广州致信药业有限公司，经中国药科大学中药资源研究室秦民坚教授鉴定为卫矛科南蛇藤属植物。将南蛇藤茎切断、粉碎成粉，烘干（15 kg），用95%乙醇（150 L）提取3 h，重复3次，合并提取液，回收乙醇，浸膏（900 g）加水分散后，石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯层，水洗涤3次，减压浓缩，真空冻干，得南蛇藤茎乙酸乙酯提取物（250 g），贮存于4℃。每1 g提取物相当于60 g生药，使用前以DMSO助溶。

1.3 RT-PCR检测mTOR mRNA表达

按GeneBank中mTOR（NM_004958）启动子的序列设计引物。上游引物P1：5’-ATCGACGCG TACTTACATTGTTGCACAACTTG-3’；下游引物P2：5’-CCGAAGATCTCTTCGGCCAAGGCCTCAGCT GC-3’，引物中包含交换配对碱基、酶切位点以及目的基因中5’端部分调取基因。RT-PCR扩增目的基因片段，20 μL总反应体系，反应参数设为：94℃5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环后72℃ 10 min。PCR鉴定阳性克隆，上游引物P3：5’-CGGCATCGCTCACATTCT-3’；下游引物P4：5’-TGGAAGACGCCAAAAACATAAAG-3’，20 μL总反应体系，设定程序94℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 40 s，30个循环后72℃ 5 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4 过表达mTOR载体的构建

载体GV238和含有mTOR启动子的PCR产物，分别以限制性内切酶MluI和BglII双酶切，连接两种纯化后的酶切产物，转化E.coli DH5α感受态，挑克隆，双酶切和PCR方法初步筛选并进行DNA序列测定。

1.5 质粒转染及荧光素酶活性检测

对数期HepG2细胞（约4×105），接种于24孔板，培养至细胞融合度为80%。严格按转染试剂盒要求，进行质粒转染及荧光素酶活性检测。步骤简述如下，将转染缓冲液按比例加入质粒中（2 μL缓冲液：0.6 μg质粒），室温静置20 min后，将该混合液加入HepG2细胞中，于孵箱中培养48 h，室温下加入裂解液反应10 min，终止反应，酶标仪检测荧光素酶相对荧光值，进行数据收集和分析。

1.6 Western Blot检测蛋白表达水平

质粒转染后的HepG2细胞，培养至对数生长期，提取总蛋白，以改良型Lowry 法测定蛋白样品浓度。所得蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，加入一抗（1：1 000），4℃过夜，再加二抗（1：4 000）室温孵育2 h，ECL显影，进行图像采集并分析。

1.7 MTT试验

取96孔板，收集对数期HepG2/mTOR++细胞，调整浓度为103-104个/孔，以无血清培养基孵育12 h后，弃上清。加入不同浓度（20、40、80、160或320 μg·mL-1）的COE（以无血清培养基配置），阳性药物为2 μg·mL-1的DDP。每种浓度设5个复孔。以含2%FBS的RPMI 1640维持培养基孵育16-48 h。每孔加入20 μL MTT溶液（5 μg·mL-1，即0.5% MTT），继续培养4 h。终止培养，弃去培养上清。每孔加入DMSO 150 μL，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。同时设置调零孔和对照孔。酶联免疫检测仪于OD 490 nm处测量各孔吸光值。

1.8 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件处理，计量数据以均数± 标准差表示，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组载体的构建及鉴定

利用PCR技术，扩增出长约2 114 bp的mTOR启动子区的片段（图1）。将PCR产物及GV238载体分别用MluI和BglII进行双酶切，酶切产物纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化E.coli DH5α感受态，挑取重组体用PCR和双酶切反应进行初步鉴定，获得大小合适的片段（约为562 bp，图2），表明获得GV238 - mTOR重组质粒。

图1 mTOR启动子PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

图2 重组克隆PCR鉴定产物的琼脂糖凝胶电泳

图3 WB检测mTOR蛋白表达水平

图4 荧光素酶相对活性检测

2.2 重组载体的测序

接种阳性转化子，37℃培养16 h后保存为甘油菌，分装200 μL，双向测序，经NCBI-BLAST比对分析，mTOR启动子基因序列与GeneBank登录的mTOR（NM_004958）序列完全同源性高达99%，表明已成功构建GV238-mTOR重组子。

2.3 Western Blot检测mTOR蛋白表达水平

收集转染GV238-mTOR重组质粒的人肝癌HepG2细胞，提取总蛋白，Western Blot检测mTOR蛋白的表达水平。结果如图3所示，与野生型人肝癌HepG2细胞相比，转染GV238-mTOR重组质粒的人肝癌HepG2（记作HepG2 / mTOR++细胞）中，mTOR蛋白的表达水平明显增加。

2.4 荧光素酶相对活性检测

将GV238空载体质粒和GV238-mTOR重组质粒分别转染人肝癌HepG2细胞，24 h后检测细胞内荧光素酶的相对荧光强度。实验结果如图4所示，与转染GV238空载体质粒的阴性对照相比，转染GV238-mTOR重组质粒的荧光强度明显增强（P＜0.01），表明成功构建高表达mTOR的人肝癌HepG2细胞株。

2.5 南蛇藤提取物对HepG2/mTOR++细胞株的影响

以MTT试验分析南蛇藤提取物对HepG2/ mTOR++细胞增殖能力的影响。结果如图5所示，与未加药组相比，药物作用24 h，南蛇藤提取物明显抑制HepG2/mTOR++肝癌细胞的增殖（P＜0.05），并具有时间浓度依赖性。同时，计算南蛇藤提取物IC50约136.13 μg·mL-1。

2.6 南蛇藤提取物对mTOR蛋白的影响

将HepG2/mTOR++细胞培养至对数期，加入不同浓度的南蛇藤提取物，并以mTOR蛋白的抑制剂Rapamycin作为阳性对照药物，Western Blot检测细胞内mTOR蛋白表达水平。结果如图6所示，南蛇藤提取物明显抑制细胞内mTOR蛋白的表达。

3 讨论

目前，干扰细胞内蛋白表达的技术主要有腺病毒感染[3]、质粒转染、转录激活样效应物核酸酶（TALEN）基因敲除[4]等，需要根据目的蛋白的分子量大小和特性选择合适的方法。mTOR蛋白分子量大（289 kDa），不易包装成腺病毒，因此，本实验室选择运用质粒转染技术构建过表达的人肝癌HepG2细胞株。肿瘤细胞中mTOR分子大量表达，可诱导酪氨酸激酶磷酸化，活化下游src、PI3K/Akt、MAPK等信号通路，激活EMT[7]，增强肿瘤细胞的侵袭转移能力。也有研究者发现，PI3K/Akt/mTOR的异常激活，也与肿瘤干细胞的表型[8]密切相关。因此，研究mTOR信号通路可以进一步认识机体的各种生理功能，为肿瘤的治疗提供新思路。

图5 南蛇藤提取物对HepG2/mTOR++细胞增殖能力的影响

图6 WB检测mTOR蛋白表达水平

很多中草药提取物具有多靶点抗肿瘤[9,10]作用，并且副作用较小。南蛇藤在中国分布甚广，药用价值始载于清代《植物名实图考》。本课题组前期研究发现，南蛇藤提取物不仅能抑制肝癌的生长和血管生成，促进树突状细胞的成熟，增强CD8+T细胞特异性抗肿瘤的细胞免疫功能；而且能在一定程度上逆转人肝癌细胞上皮间质转化[5]（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）过程。初步分析南蛇藤提取物抗癌的分子机制，可能与mTOR[6]信号通路相关。为了探讨南蛇藤提取物能否抑制肝癌细胞中mTOR的表达，本研究构建了HepG2/mTOR++细胞株，并发现南蛇藤提取物呈浓度依赖性地抑制人肝癌HepG2细胞的增殖，降低mTOR的表达水平。但南蛇藤提取物是否通过靶向mTOR逆转EMT，还需要分析药物作用与EMT标记蛋白（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）的表达水平之间的相关性。另外，还需要建立用RNAi沉默表达mTOR的HepG2肝癌细胞模型，以不同浓度的南蛇藤总萜干预，系统研究南蛇藤总萜靶向mTOR通路抑制肝癌细胞EMT的分子机制。同时，课题组还会建立原位/尾静脉接种的肝癌裸鼠模型，通过分子示踪技术，动态观察南蛇藤总萜对肝癌移植瘤生长以及转移能力的影响。

下一步研究，拟对南蛇藤提取物通过靶向mTOR抑制肝癌EMT的具体分子信号通路，进行更深入的探讨。

1 Yu J, Thomson T C, Johnson J. Cross talk between estradiol and mTOR Kinase in the regulation of ovarian granulosa proliferation. Reprod Sci, 2012, 19(2)：143-151.

2 Lin J F, Tsai T F, Liao P C, et al. Benzyl isothiocyanate induces protective autophagy in human prostate cancer cells via inhibition of mTOR signaling. Carcinogenesis, 2013, 34 (2)：406-414.

3 Prelich G. Gene overexpression: uses, mechanisms, and interpretation. Genetics, 2012, 190(3)：841-854.

4 张文美,丁妍,郭兴荣,等. TALEN介导的CXCR4敲除肝癌细胞株的建立.生物技术通报,2016,32(2)：225-228.

5 钱亚云,曹玲,刘延庆,等.南蛇藤提取物增强抑癌基因Maspin抑制人胃癌细胞株MGC803侵袭能力的研究.世界科学技术-中医药现代化,2014,16(11)：2470-2474.

6 钱亚云,金凤,曹玲,等.南蛇藤提取物对人肝癌细胞HepG2上皮间质转化的影响.世界科学技术-中医药现代化,2014,16(12)：2647-2651.

7 Chang L, Graham P H, Hao J, et al. Acquisition of epithelialmesenchymal transition and cancer stem cell phenotypes is associated with activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway in prostate cancer radioresistance. Cell Death Dis, 2013, 4 (10)：e875.

8 Kong D, Li Y, Wang Z, et al. Cancer stem cells and epithelial-tomesenchymal transition (EMT) -phenotypic cells: are they cousins or twins? Cancers (Basel), 2011, 21, 3(1)：716-729.

9 唐鼎,王程,李娟,等.清癌汤体外抗肿瘤作用及其机制研究.世界科学技术-中医药现代化,2015,17(12)：2570-2576.

10 王俊,尹萌,韩东冬,等.银杏外种皮提取物重金属元素与银杏酸测定.世界科学技术-中医药现代化,2016,18(1)：65-68.

Effects of Celastrus orbiculatus Thunb. Extract on the Overexpression of mTOR in Human HepG2 Cells

Qian Yayun, Lu Songhua, Zhao Xueyu, Yang Ting, Shi Youyang, Jin Feng, Liu Yanqing
(Medical College, Yangzhou University, Yangzhou 225003, China)

This study aimed at investigating the effects of the extract of Chinese herb, Nansheteng (C. orbiculatus Thunb.), on human HepG2 cells through the overexpression of mTOR. The GV238-mTOR recombinant plasmids were transfected into HepG2 cells using molecular biological technology. The expression level of mTOR was evaluated by means of relative activity of luciferase and western blot. Human hepatic carcinoma HepG2/mTOR++cells were treated with C. orbiculatus extract in different concentrations (20, 40, 80, 160 and 320 μg·mL-1) for 24 h. The mTOR protein expression was detected by western blot. It was found that the protein expression of mTOR in transfected HepG2 cells was significantly enhanced. C. orbiculatus extract significantly inhibited the proliferation of HepG2/mTOR++cells. Simultaneously, C. orbiculatus extract inhibited mTOR at its protein level in a dose-dependent manner. In conclusion, we successfully constructed recombinant mTOR cloning vectors, and established the stable HepG2 cell line with the overexpression of mTOR. Besides, C. orbiculatus extract significantly inhibited mTOR protein expression in human hepatic carcinoma HepG2 cells.

Celastrus orbiculatus Thunb., hepatic carcinoma, overexpression, mammalian target of rapamycin

10.11842/wst.2016.12.018

R285.5

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-10-17

修回日期：2016-11-29

＊ 国家自然科学基金委青年基金项目（81403232）：南蛇藤提取物靶向PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制肝癌早期转移的作用及机制研究，负责人：钱亚云；国家自然科学基金委面上项目（81274141）：南蛇藤总萜通过协同抑制Notch和VEGF的表达阻断肝癌血管生成的作用机制，负责人：刘延庆；江苏省自然科学基金委面上项目（BK2012686）：南蛇藤提取物增强抑癌基因MASPIN表达抑制胃癌转移的机制研究，负责人：钱亚云；教育部博士点基金新教师类项目（20133250120003）：南蛇藤总萜靶向mTOR信号通路抑制肝癌转移的分子机制研究，负责人：钱亚云。

＊＊ 通讯作者：钱亚云，副教授，硕士生导师，博士，主要研究方向：中西医结合抗肿瘤研究。