复方大黄膏抗炎镇痛作用研究

金 照陈智耶袁玉青郑艳艳王 辰金可可

复方大黄膏抗炎镇痛作用研究

金 照1陈智耶1袁玉青1郑艳艳1王 辰1金可可2

小鼠；复方大黄膏；抗炎；镇痛；炎症介质

复方大黄膏为肛肠科外用药,具有止痛、消肿、止血等功效。本实验对该药物的抗炎镇痛作用及其机制进行研究，并与马应龙麝香痔疮膏作对照，为进一步开发该药提供实验依据。

1 材 料

1.1 动 物 选用8周龄健康雄性ICR小鼠，合格证书:SYXK（浙）2015-0009，体质量（25±5）g，由温州医科大学实验动物中心提供，给予颗粒饲料喂养，自由饮水。

1.2 药品和试剂 复方大黄膏成分为大黄、白芨、三七、甘草，由温州市中西医结合医院中药制剂室制备。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β （IL-1β）Ⅰ抗购自Santa Cruz，Ⅱ抗购自武汉安特捷生物技术有限公司，其它试剂为进口分装或国产分析纯。

2 方 法

2.1 消肿实验 采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法。雄性50只随机均分为复方大黄膏高、中、低剂量组（分别以5g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg的药物外用）、马应龙麝香痔疮膏组（2.5g/kg）、赋形剂对照组（复方大黄膏赋形剂凡士林2.5g/kg）。二甲苯0.05mL均匀涂于小鼠右耳前、后两面致炎，1h后各实验组小鼠致炎耳廓上再分别均匀涂以相应药物或赋形剂，4h后将小鼠颈椎脱位致死，沿耳廓基线用直径8mm打孔器在左右两耳同一部位打下双耳片，分析天平上称重，求两耳片重量之差。按以下公式计算肿胀度和抑制率:肿胀度（%）=（右耳重-左耳重）/左耳重×100%，抑制率（%）=［（对照组肿胀度均数-用药组肿胀度均数）/对照组肿胀度均数］×100%。

2.2 镇痛实验 采用热板法及醋酸扭体法。热板法:恒温器水温调节至（55±0.5）℃，将500mL烧杯放入其中，烧杯底部接触水面。每次取小鼠1只，放入烧杯内。记录自放入烧杯至出现舔后脚所需时间（s），作为该鼠的痛阈值。如30s内不出现舔后足者，则弃之不用。依次测量各小鼠的痛阈值，预选合格小鼠100只，随机分为五组，组别同消肿实验，重新测痛阈1次。将两次痛阈的平均值作为该鼠给药前的痛阈值。然后各组均灌胃给药（剂量同消肿实验），给药后30、60、120min分别测定各小鼠痛阈值。若60s仍无反应，即取出，其痛阈按60s计算。醋酸扭体法:动物、分组、给药同热板法。取0.6%醋酸溶液，按0.1mL/10g剂量，腹腔注射，观察15min内各动物出现扭体反应的次数。

2.3 抗炎实验 采用蛋白印迹法（Western blotting）检测组织肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）蛋白的表达。取上述2.1中各组的右耳组织于-70℃储存备用。全细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移到PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭1h，Ⅰ抗4℃孵育过夜。Ⅱ抗室温孵育2h后ECL发光，暗室中曝光、显影、定影。Quantity One凝胶软件分析系统分析蛋白条带的光密度值，以GAPDH为内参照进行蛋白定量。

2.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件分析。所有数据进行正态性检验，用（±s）表示。多组样本均数比较采用方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齐性者两两比较采用LSD法，方差不齐者则进行Dunnet’s T3检验。

3 结果

3.1 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 与赋形剂对照组比较，复方大黄膏低、中、高剂量组耳肿胀度均显著减轻，差异有统计学意义（孕＜0.05或孕＜0.01），抑制率以高剂量组最为明显，显示良好的量效关系，见表1。

表1 复方大黄膏对二甲苯所致小鼠耳肿胀度的影响（%，±s）

表1 复方大黄膏对二甲苯所致小鼠耳肿胀度的影响（%，±s）

注:与赋形剂对照组比较，*孕＜0.05，**孕＜0.01

组别赋形剂对照组复方大黄膏低剂量组复方大黄膏中剂量组复方大黄膏高剂量组马应龙麝香痔疮膏组鼠数10 10 10 10 10肿胀度111.24±20.21 88.45±19.31* 80.33±16.41** 71.91±13.29** 81.70±15.52**抑制率0 20.49 27.79 35.36 26.56

3.2 对小鼠热板法致痛和醋酸扭体反应的影响 热板法结果显示，与赋形剂对照组比较，复方大黄膏中、高剂量组均明显提高用药后30、60、120min小鼠的痛阈值，复方大黄膏低剂量组可明显提高用药后30、60min小鼠的痛阈值，差异有统计学意义（孕＜0.05），见表2。醋酸扭体法结果显示，与赋形剂对照组的（32.46±7.64）次比较，复方大黄膏中、高剂量组扭体次数分别为（19.48±6.02）次、（15.22±6.60）次，均明显减少，差异有统计学意义（孕＜0.01）。提示复方大黄膏具有良好的镇痛作用。

3.3 对 TNF-α和 IL-1β表达的影响 Western blotting结果显示，与赋形剂对照组比较，复方大黄膏低、中、高剂量组TNF-α和IL-1β蛋白表达均明显降低（孕＜0.05），且高剂量组与低、中剂量组比较，差异有统计学意义（孕＜0.05），见图1。提示复方大黄膏对炎症介质表达具有明显的抑制作用。

表2 复方大黄膏对小鼠热板致痛作用实验结果（s±s）

表2 复方大黄膏对小鼠热板致痛作用实验结果（s±s）

注:与赋形剂对照组比较，*孕＜0.05

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4 讨论

由于肛门部解剖学和生理学特点决定肛门部疾病容易感染，发作时疼痛明显，术后愈合的时间长。细菌及细菌释放内毒素的作用是引起创面愈合延缓的主要因素，内毒素不但引起创面炎性细胞浸润，还可引起炎性细胞因子释放，从而加重局部炎症反应，导致创面水肿，并形成水肿肉芽，减少成纤维细胞增生及向胶原纤维转化。TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质之一，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，并促使其他细胞因子的合成和释放[1]；IL-1β是急性炎症反应的关键介质，是启动炎性反应的关键细胞因子之一[2]。复方大黄膏主要成分为大黄、白芨、三七、甘草，按照7：3：2：1配制。本研究发现，复方大黄膏低、中、高三个剂量组对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀具有明显的抑制作用，均明显抑制TNF-α和IL-1β蛋白的表达。提示复方大黄膏可通过抑制TNF-α和IL-1β的表达，发挥抗炎作用。

图1 复方大黄膏对小鼠肿胀耳廓TNF-α和IL-1β蛋白表达的影响

热板法结果显示，复方大黄膏中、高剂量组均明显提高用药后30、60、120min小鼠的痛阈值，低剂量组可明显提高用药后30、60min小鼠的痛阈值，中、高剂量能明显减少小鼠扭体次数，表明该药对化学和物理刺激造成的疼痛反应均有明显的镇痛效果。研究发现，炎症反应与疼痛反应有密切关系，炎症反应使血管通透性增高，血液成分进入组织中，组织中的感觉神经受到炎症因子的刺激，可发生疼痛反应[3]。因此，本研究中复方大黄膏缓解疼痛的作用可能也与抑制TNF-α和IL-1β等炎症介质的释放，从而抑制炎症反应有关，其具体机制有待于进一步研究。

［1］Vandenbroucke RE，Dejonckheere E，Van Hauwermeiren F，et al.Matrix metalloproteinase 13 modulates intestinal epithelial barrier integrity in inflammatory diseases by activating TNF［J］.EMBO Mol Med，2013，5（7）:932-948.

［2］师伟，刘瑞芬，杨晓娜，等.活血化瘀法对慢性盆腔炎雌性大鼠血清前炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8水平的影响［J］.中国医学创新，2012，9（32）:1-3.

［3］Esfahani HM，Esfahani ZN，Dehaghi NK，et al.Anti-inflammatory and anti-nociceptive effects of the ethanolic extracts of Alkanna frigida and Alkanna orientalis［J］.J Nat Med，2012，66（3）:447-452.

（收稿:2016-03-24 修回:2016-05-31）

浙江省自然科学基金项目（No.Y207495）；浙江省温州市科技计划项目（No.Y20130315）

1浙江省温州市中西医结合医院中医肛肠科（温州 325000）；2温州医科大学（温州 325000）

金可可，Tel:13868306996