冬虫夏草提取物对混合淋巴细胞培养体系Treg/Th17轴的影响

杨 梅 张 岩 金 昊 李一夫 夏 鹏 郑少玲 蔡 勇 陈必成 杨亦荣

冬虫夏草提取物对混合淋巴细胞培养体系Treg/Th17轴的影响

杨 梅 张 岩 金 昊 李一夫 夏 鹏 郑少玲 蔡 勇 陈必成 杨亦荣

目的观察冬虫夏草提取物对混合淋巴细胞（MLC）培养体系Treg/Th17轴的影响，探讨冬虫夏草提取物的免疫调节机制。方法体外建立单向混合淋巴细胞培养体系，用冬虫夏草提取物干预培养体系，在不同的时间点收集细胞，采用流式细胞术检测细胞中辅助性T细胞17（Th17细胞）和CD4+CD25+T调节性T淋巴细胞（Treg细胞）的比例，并计算出Th17细胞与Treg细胞的比值；采用酶联免疫吸附试验法分别检测培养液白细胞介素（IL）-17、IL-23、IL-2和IL-6的浓度。结果冬虫夏草提取物干预组12、24、36h三个时间点T细胞中Treg细胞比例分别为（13.17± 1.25）%、（12.3±1.31）%、（11.89±1.46）%，同时间点对照组T细胞Treg细胞比例分别为（11.04±1.32）%、（10.16±1.15）%、（8.91±0.97）%，差异均有统计学意义（P＜0.05）；干预组T细胞中Th17细胞比例分别为（2.81±0.13）%、（4.02±0.38）%、（4.95±0.49）%，同时间点的对照组T细胞中Th17细胞比例分别为（4.65±0.31）%、（6.63±0.63）%、（8.03±0.76）%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。冬虫夏草提取物干预组12、24、36h三个时间点T细胞中Th17细胞与Treg细胞的比例均显著低于同时间点的对照组（P＜0.05）。冬虫夏草提取物干预组12、24、36h三个时间点培养液IL-2水平明显高于同时间点对照组（P＜0.05），而干预组培养液IL-6、IL-17、IL-23水平低于同时间点的对照组（P＜0.05）。结论冬虫夏草提取物能够明显促进MLC体系细胞中Treg细胞增殖，抑制Thl7细胞增殖，降低Th17/Treg细胞比值，改变Th17/Treg轴的平衡，同时增加IL-2分泌、减少IL-6、IL-17、IL-23分泌，有利于诱导免疫耐受。

冬虫夏草提取物；细胞分化；辅助性T细胞17；调节性T细胞；细胞因子

冬虫夏草（cordyceps sinensis，CS）是我国传统中药，现代科学研究证实了冬虫夏草有抗肿瘤、降血压、调节内分泌、增强免疫力、镇静中枢、抗心肌缺血及调节心率等功能，临床上人工冬虫夏草制剂用于肾脏移植已近20年，疗效显著。我们前期对冬虫夏草提取物治疗移植动脉硬化的研究结果表明，冬虫夏草可以减少T淋巴细胞浸润，减轻慢性排斥反应，延缓大鼠移植动脉硬化的进展[1-2]；但其抗慢性排斥的机理不明。本研究通过观察冬虫夏草提取物对混合淋巴细胞（MLC）培养体系Treg/Th17轴及细胞因子的影响，探讨冬虫夏草提取物的免疫调节机制。

1 实验材料

1.1 药 物 冬虫夏草提取物的制备：冬虫夏草在15℃恒温下培养45天，取冬虫夏草菌丝体，经过滤、干燥和粉碎成为超细粉。超细粉经过乙醇提取、水提取和酶解，溶解至水中，4℃冰箱保存。

1.2 试 剂 RPMI-1640培养基为美国GIBCO公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品，丝裂霉素为浙江海正药业公司产品，BCA蛋白浓度测定试剂盒为江苏碧云天生物研究所产品。FITC标记的CD4单克隆抗体，PE标记的白细胞介素（IL）-17A、CD25单克隆抗体均购自美国eBioscience公司。小鼠IL-2、IL-6、IL-17A和 IL-23酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒均购自美国eBioscience公司。

1.3 动 物 受鼠为BALB/c小鼠，雌性；供鼠为C57BL/6小鼠，雄性；均为清洁级近交系小鼠，鼠龄8～12周，温州医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（浙）2010-0150。所有小鼠给予标准规格的啮齿类食物喂养，可自由饮水。喂养环境设置：12h：12h人工白天黑夜循环，维持室内温度（21±2）℃，湿度（55±2）%。

2 试验方法

2.1 单向MLC培养体系的建立 将C57BL/6小鼠（供鼠）颈椎脱臼处死，置入75%的乙醇中浸泡10 min，在超净台内无菌取出小鼠脾脏，置于200目金属过滤网上，匀浆器芯轻轻研磨，制成脾细胞悬液，用RPMI-1640液洗2次。调整细胞含量为1×109/L。经台盼蓝染色后计算细胞存活率（＞95%）。计数板计数并将C57BL/6小鼠脾细胞调2×109/L作为反应细胞。BALB/c小鼠（受鼠）的脾细胞取法同上。将BALB/ c小鼠脾细胞含量调至1×109/L，加入丝裂霉素至终浓度25mg/L，于37℃水浴作用30min，用无血清RPMI-1640培养基洗涤2次，除去残余的丝裂霉素，调整细胞含量至2×109/L，作为刺激细胞。将已制备好的供受鼠脾细胞按如下分组加入24孔板，每孔加入反应细胞和刺激细胞各0.1mL。实验分组：对照组不加任何处理，冬虫夏草组每孔加入无菌处理过的2mmol/L虫草提取物，每组设3个复孔，各组均置于37℃ 5%CO2孵箱进行培养。在培养的12、24、36h时收集各实验孔的细胞。

2.2 CD4+CD25+T及Th17+T细胞检测 制备淋巴细胞悬液，将淋巴细胞浓度调整为5×108/L，加入异硫氰基荧光素（FITC）标记的抗CD4单抗和藻红蛋白（PE）标记的抗CD25单抗，上机检测。以阴性对照管设门参数，检测CD4+CD25+T细胞。将淋巴细胞密度调整为5×106/mL，加入异硫氰基荧光素（FITC）标记的抗CD4单抗和藻红蛋白（PE）标记的抗白细胞介素（IL）-17单抗，破膜后上机检测，以阴性管设门参数作为对照，检测CD4+IL-17+Th17细胞比例。

2.3 培养液IL-17和IL-23水平测定 取培养液，使用小鼠IL-2、IL-6、IL-17A和IL-23酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒分别检测培养液中IL-2、IL-6、IL-17A和IL-23的水平，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

2.4 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行处理，计量资料用均数±标准差（±s） 表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 冬虫夏草提取物对Treg细胞分化和增殖的影响 对照组12、24、36h三个时间点CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例随时间延长而下降，呈时间依赖性。冬虫夏草组12、24、36h三个时间点CD4+ CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例均显著高于同时间点的对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1，图1（封二）。

3.2 冬虫夏草提取物对Th17细胞分化和增殖的影响 对照组12、24、36h三个时间点CD4+Th17+T细胞占CD4+T细胞的比例随时间延长而增加，呈时间依赖性。冬虫夏草组12、24、36h三个时间点CD4+ Th17+T细胞占CD4+T细胞的比例均显著低于同时间点的对照组（P＜0.05），见表1，图2（封二）。

3.3 冬虫夏草提取物对Th17/Treg细胞比值的影响

对照组12、24、36h三个时间点Th17/Treg细胞比值随时间延长而升高，呈时间依赖性。冬虫夏草组12、24、36h三个时间点TTh17/Treg细胞比值均显著低于同时间点的对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

3.4 冬虫夏草提取物对混合淋巴培养体系IL-2、IL-6、IL-17和IL-23表达水平的影响 对照组12、24、36h三个时间点IL-2浓度随时间延长而升高，呈时间依赖性。冬虫夏草组12、24、36h三个时间点IL-2浓度均显著高于同时间点的对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。对照组12、24、36h三个时间点IL-6、IL-23、IL-17浓度分均随时间延长而下降，呈时间依赖性。冬虫夏草组12、24、36h三个时间点IL-6、IL-23、IL-17浓度均显著低于同时间点的对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 各组混合淋巴细胞培养体系CD4+CD25+Treg、CD4+Th17细胞的分布（%，±s）

表1 各组混合淋巴细胞培养体系CD4+CD25+Treg、CD4+Th17细胞的分布（%，±s）

注：与12h比较，*P＜0.05；与24h比较，△P＜0.05；与同时间点对照组比较，▲P＜0.05；Treg：调节性T淋巴细胞；Th17：辅助性T淋巴细胞17

时间12h 24h 36h对照组冬虫夏草干预组Treg 11.04±1.32 10.16±1.15* 8.91±0.97*△Th17 4.65±0.31 6.63±0.63* 8.03±0.76*△Th17细胞/Treg细胞0.42±0.06 0.65±0.07* 0.89±0.11*△Treg 13.17±1.25▲12.3±1.31*▲11.89±1.46*△▲Th17 2.81±0.13▲4.02±0.38*▲4.95±0.49*△▲Th17细胞/Treg细胞0.21±0.03▲0.33±0.05*▲0.41±0.08*△▲

表2 各组淋巴细胞培养液IL-2、IL-6、IL-17和IL-23表达水平（pg/mL±s）

表2 各组淋巴细胞培养液IL-2、IL-6、IL-17和IL-23表达水平（pg/mL±s）

注：与12h比较，*P＜0.05；与24h比较，△P＜0.05；与同时间点对照组比较，▲P＜0.05；IL-2：细胞介素-2；IL-6：白细胞介素-6；IL-17A：白细胞介素-17A；IL-23：白细胞介素-23

时间12h 24h 36h对照组 冬虫夏草干预组IL-2 125.13±15.39 139.82±20.36* 157.69±21.09*△IL-6 120.64±11.06 132.07±13.39* 138.74±14.15*△IL-17A 61.79±11.55 75.58±14.34* 83.03±16.25*△IL-23 112.70±18.75 96.31±14.61* 87.16±12.85*△IL-2 144±19.37▲176±24.11*▲189.35±32.15*△▲IL-6 102.73±8.65▲114.47±9.37*▲122.31±9.89*△▲IL-17A 46.17±7.46▲58.02±9.86*▲63.97±10.99*△▲IL-23 81.49±12.77▲74.93±10.08*▲59.82±7.63*△▲

4 讨 论

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis（Berk）Sace.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。最近一些研究证实冬虫夏草能延长异体皮肤移植物和心脏移植的存活时间，和环孢素A有协同效应，与环孢素A联用可以抑制排斥反应，同时减少环孢素A引起的蛋白尿和延缓慢性移植物肾脏病的进展[3]。He等[4]研究表明，冬虫夏草对慢性移植物肾脏病有一定的治疗作用，它可以减轻肾小球及肾小管间质损害。此外，冬虫夏草能显着降低CD8+T细胞活性，抑制急性排斥反应，减轻移植物血管病[5]。我们前期的研究发现冬虫夏草提取物有显著地抗移植物血管病的作用，并且有显著的抗慢性排斥的作用[1-2]，但其抗慢性排斥的机制不明。

调节性T细胞（Treg）中以对CD4+CD25+的T调节性淋巴细胞的研究最为突出。在体内，CD4+ CD25+Treg可抑制CD4+T细胞介导的排斥反应[6]；CD4+CD25+Treg可抑制抗原特异性CD8+T细胞介导的排斥反应[7]；CD4+CD25+Treg可直接或间接作用于抗原提呈细胞（APC），从而影响细胞因子的产生，下调共刺激分子的表达，通过促进凋亡而清除效应细胞[8-9]。在免疫耐受形成的过程中，IL-2参与诱导初始CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+T细胞并表达Foxp3，使其具备调节性T细胞的特性[10]。

近年研究发现，机体存在一种新型的不同于Th1 和Th2的CD4+效应细胞——辅助性T细胞17型（T help cell 17，Th17），该细胞是由天然T细胞前体分化而来，具有独立的分化和调节机制，特异性产生白介素（interleukin 17，IL-17）效应因子，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义[11]。IL-23主要参与Thl7细胞的扩增以及功能的维持12。IL-2是Th17细胞分化的抑制因素，它通过STAT5信号传导对Th17细胞的分化起到抑制作用[12]Th17细胞除了分泌IL-17以外还可以产生IL-21、IL-22、TNF-α和IL-6等炎性因子，Thl7细胞在疾病中的作用主要是促进器官特异性的自身免疫性疾病和慢性感染的防御[13]。研究证实，IL-23或者IL-17缺陷小鼠可以降低自身免疫病和慢性感染的易感性，而近期的一些研究也表明，TH17细胞可以加速移植物血管病的进程，介导移植血管硬化[14-15]。

正常体内Treg与Th17细胞保持平衡状态，而当炎症等情况时Th17细胞分化增强比例增加导致Treg/Th17失衡，是引起多种自身免疫病以及移植排斥的重要原因[16]。Treg细胞与Th17细胞之间存在复杂的相关关系，二者在功能上相互拮抗，而在分化上却具有相关性。Treg/Th17的平衡在器官移植、自身免疫性疾病中有着重要的作用[17]。Treg/Th17的平衡能够抑制炎症反应[18]，减轻排斥，诱导免疫耐受，在大鼠的肝脏移植[19]及人类的移植物抗宿主病[20]中均得到了证实。通过调控Th17细胞/Treg细胞比值可以维持体内免疫稳态的平衡，该比值升高时，自身免疫及促炎效应占优势，比值降低时，免疫耐受及抗炎效应占优势。

本实验发现干预组Treg细胞显著高于同时间点的对照组，而Th17细胞显著低于同时间点的对照组，干预组的Th17/Treg细胞比值也显著低于同时间点的对照组。表明冬虫夏草提取物可以显著促进Treg细胞增殖，抑制Th17细胞增殖，降低Th17/Treg细胞比值，改变Th17/Treg轴的平衡，诱导T细胞向Treg分化，抑制T细胞向Th17细胞分化。同时检测培养体系中一系列细胞因子的表达水平，发现干预组IL-2水平显著高于同时间点的对照组；IL-6、IL-17和IL-23表达水平显著低于同时间点的对照组。这表明冬虫夏草提取物可以提高IL-2水平，降低IL-6、IL-17和IL-23表达水平。而IL-2正是CD4+ CD25+细胞扩增所必需的细胞因子。这也是冬虫夏草提取物诱导T细胞向Treg分化的一个分子水平的证据。另外冬虫夏草提取物降低了IL-6、IL-17和IL-23表达水平，这可能是其抑制T细胞向Th17细胞分化，Th17细胞数量减少，分泌的IL-6、IL-17和IL-23也相应的减少，这些促炎因子的减少也有利于诱导免疫耐受。

综上所述，本实验结果显示，冬虫夏草提取物能改变Th17/Treg轴的平衡，诱导T细胞向Treg分化，抑制T细胞向Th17细胞分化。提高单向混合淋巴细胞培养体系中IL-2表达水平，降低IL-6、IL-17和IL-23表达水平。其诱导免疫耐受的作用机制可能是通过改变Th17/Treg轴的平衡，提高抗炎细胞因子，降低炎性细胞因子来实现的，具体机制有待于在动物实验及临床试验进一步验证。

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（收稿：2015-08-11 修回：2015-10-10）

Influence of Cordyceps Sinensis Extract on the Treg/Th17 Axis of Mixed Lymphocyte Culture Technique

YANG Mei,ZHANG Yan,允IN Hao,Li Yifu,XIA Peng,ZHENG Shaoling,CAI Yong,CHEN Bicheng,YANG Yirong.Department of Intensive Care Unit（YANG Mei）,Centre for Transplantation（ZHANG Yan,JIN Hao,Li Yifu,XIA Peng,ZHENG Shaoling,CAI Yong,YANG Yirong）,Department of Surgery Laboratory（CHEN Bicheng）, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medicine University,Wenzhou(325000),China

ObjectiveTo investigate the influence of Cordyceps sinensis extract on the Treg/Th17 axis of mixed lymphocyte culture（MLC）system,in order to explore the immune regulation mechanism of Cordyceps sinensis extract.MethodsOne-way mixed lymphocyte culture system was established in vitro,then was interfered with Cordyceps sinensis extract.Cells were collected at different time points for detection of Th17 cells and Treg cells by flow cytometry;the ratio of TH17 cells to Treg cells was calculated.Enzyme linked immunosorbent assay was used to determine concentrations of interleukin（IL）-17,IL-23,IL-2 and IL-6 in the medium.ResultsAt 12,24, 36 h after treatment,the percentage of Treg cells in Cordyceps sinensis extract group were 13.17%±1.25%,12.3%± 1.31%,11.89%±1.46%,those in control group were 11.04%±1.32%,10.16%±1.15%,8.91%±0.97%;the difference between the 2 groups was statistically significant（P＜0.05）.At the same time points,the percentage of Th17 cells in Cordyceps sinensis extract group were 2.81%±0.13%,4.02%±0.38%,4.95%±0.49%,those in control group were 4.65%±0.31%,6.63%±0.63%,8.03%±0.76%,with significant difference between 2 groups（P＜0.05）.The ratio of TH17/Treg in Cordyceps sinensis extract group was significantly lower than that of control group at the same timepoints（P＜0.05）.IL-2 levels of the medium in Cordyceps sinensis extract group were significantly higher than those in the control group at the same time points（P＜0.05）,while IL-6,IL-17,and IL-23 levels were significantly lower than those in control group（P＜0.05）.ConclusionCordyceps sinensis extract can obviously promote the proliferation of Treg cells,inhibit the proliferation of Thl7 cells,resulting in the decrease of the ratio of Th17/Treg and consequently changing the balance of Th17/Treg axis in the system of MLC cells.Meanwhile,Cordyceps sinensis extract can increase the secretion of IL-2,reduce the secretion of IL-6,IL-17,IL-23,which is advantageous to the induction of immune tolerance.

Cordyceps sinensis extract;cell differentiation;Th17cells;regulatory T cells;cytokine

浙江省温州市科技计划项目（No.Y20120207，Y20120158）；浙江省自然科学基金资助项目（No.LQ13H100003，No.LQ16H100003）

温州医科大学附属第一医院重症医学科（杨梅）、移植中心（张岩、金昊、李一夫、夏鹏、郑少玲、蔡勇、杨亦荣）、外科实验室（陈必成）（温州 325000）

张岩，E-mail：biobabry@163.com