槐耳清膏抑制小鼠模型人胃癌MKN-45细胞生长和转移的实验研究

张袁骕程向东徐志远吕 航杜义安汤加宁罗华荣

槐耳清膏抑制小鼠模型人胃癌MKN-45细胞生长和转移的实验研究

张袁骕1程向东2徐志远2吕 航2杜义安3汤加宁1罗华荣4

目的研究槐耳清膏对人胃癌MKN-45细胞在裸鼠体内生长和转移的抑制作用，并探讨其作用机制。方法采用BALB/c裸鼠建立人胃癌MKN-45细胞淋巴结转移模型，随机分为槐耳清膏组、空白对照组，每组20只。建模后，每5天测量裸鼠荷瘤并计算肿瘤相对体积（RTV）；用药5周后处死裸鼠，Real-time qPCR检测肿瘤组织Wnt、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin和VEGF表达水平。结果槐耳清膏组末次测得的足垫瘤RTV为（662.75±450.66）mm3，明显小于空白对照组的（1611.85±611.83）mm3（P＜0.01）。槐耳清膏组淋巴结转移率8/20（40%）与对照组15/20（70%）相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。槐耳清膏组肿瘤组织Wnt、β-catenin、N-cadherin和VEGF的△CT值分别为（11.36±1.32）、（11.31±1.76）、（12.82±2.22）、（13.22±1.52），均高于对照组的（9.48±2.07）、（9.37±1.88）、（7.74±2.64）、（11.04±1.61），而E-cadherin的△CT值（8.26±2.39）低于对照组的（10.64± 1.48）（P＜0.05）。结论 槐耳清膏可抑制人胃癌MKN-45细胞在裸鼠上的生长及转移，其机制可能与抗血管生成和阻碍上皮间质转化（EMT）过程有关。

裸鼠；槐耳清膏；人胃癌MKN-45细胞；淋巴结转移；上皮间质转化

KEY WORDSnude mice;trametes robiniophila;human gastric cancer cell line MKN-45;lymphatic metastasis; EMT

胃癌（gastric cancer，GC）是消化系统最常见的恶性肿瘤，也是癌症死亡的第二大常见原因，仅仅2012年估计全球范围内就有新发 951,600例和723100死亡病例[1]。目前早期发生的肿瘤细胞转移是胃癌预后不佳的主要原因，其中淋巴结转移是主要转移扩散途径之一。所以有必要寻找一种有效抑制胃癌转移的治疗方法，降低胃癌的转移及死亡。槐耳是一种在中国已经使用了将近1600年的药用真菌，而近几十年才发现其抗肿瘤特性，并逐渐应用于肿瘤的辅助治疗之中。研究[2-4]表明，槐耳可以促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和转移、抑制血管生成、增加化疗疗效及免疫系统功能。尽管槐耳的抗肿瘤特性已经被发现，但至今相关的研究成果仍是相当有限，且其确切的抗肿瘤机制仍是未知的。本实验采用将人胃癌MKN-45细胞系接种于裸鼠足垫皮下，建立胃癌裸鼠淋巴结转移模型，并用槐耳多糖提取物灌胃方式对其进行治疗，观察肿瘤生长情况及治疗效果，旨在为槐耳对抗胃癌生长及淋巴结转移治疗提供依据。

1 实验材料

1.1 动物及细胞株 4～6周龄BALB/c无胸腺裸鼠40只，雄性，体质量（20±2）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证 [SCXK（沪）2013-6016]。人胃癌MKN-45细胞株购自南京凯基生物科技有限公司。

1.2 主要试剂 胎牛血清、RPMI 1640培养液和胰蛋白酶（美国Gibco公司）；槐耳清膏（启东盖天力药业有限公司）溶于生理盐水中，配成200mg/mL，20μm滤膜过滤除菌，4℃保存待用；RNA提取试剂盒（AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit，LOT：148052230，德国QIAGEN公司）；cDNA逆转录酶试剂盒（LOT：AK5102，日本TaKaRa公司）；SYBR染料法实时荧光定量试剂盒（LOT：AK6406，日本TaKaRa公司）。

1.3 主要仪器 37℃恒温细胞CO2培养箱（德国Heraeus公司，型号B5060EU）；生物安全柜（美国Thermo公司，型号Forma Class II，A2）；倒置相差显微镜（德国LEICA公司，型号DM2000）；石蜡切片机（德国LEICA公司，型号RM2235）；台式高速离心机（力新仪器，型号Neofuge 23R）；台式点动离心机（其林贝尔仪器制造有限公司，型号LX-200）；Real-time qPCR仪器（美国Applied Biosystems公司，7900HT Fast Real-time PCR System）。

2 实验方法

2.1 接种细胞培养及准备 人胃癌MKN-45细胞株用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2条件下培养；观察细胞，当细胞处于对数生长期，用PBS洗涤细胞去除残留培养基，再用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化后用PBS制成单细胞悬液，显微镜下计数，浓度为5×107/mL，制备好的细胞悬液于冰水浴中保存，于30min内进行接种。

2.2 胃癌淋巴结转移动物模型的建立 无菌条件下，取上述MKN-45细胞悬液，50μL/只接种于裸鼠右下肢足垫，观察人胃癌MKN-45细胞在裸鼠足垫生长和成瘤及转移情况。

实验分组：将建模后的40只裸鼠随机分成为槐耳清膏组[槐耳清膏5g/（kg·2d）灌胃]、空白对照组[生理盐水0.5mL/2d灌胃]，每组各20只。

2.3 肿瘤体积测量 建模2周后，每5天测量并记录接种MKN-45细胞足垫大小变化，计算足垫瘤相对体积（relative tumor volume，RTV）=πxyz/6（x为长度，y为宽度，z为厚度）。

淋巴结转移观察：连续给药5周后处死足垫成瘤的裸鼠，解剖腘窝淋巴结，经常规病理HE染色，判断是否存在转移，以转移数/成功建模数计算淋巴结转移率。

2.4 Real-time qPCR检测足垫瘤组织中相关mRNA表达 留取实验裸鼠的足垫瘤组织，用RNA试剂盒提取其总RNA，用紫外分光光度计在260和280nm处测吸光度D值，计算RNA含量和纯度，按cDNA反转录酶试剂盒说明书进行操作，取3μgRNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR引物均由生工生物股份有限公司合成，其中β-Actin为内参照，见表1。用Real-time qPCR方法检测上述相关mRNA的表达量，反应体系（20μL）：SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2x）10μL，上下游引物各 0.8μL，cDNA模板 2μL，ROX Reference Dye（50x）0.4μL，dH2O6μL。PCR反应条件：95℃，30sec；40个循环：95℃，3sec；60℃，30sec。

2.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（±s） 表示，组间比较采用t检验，淋巴结转移率比较采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

表1 Real-time qPCR引物序列

3 结 果

3.1 槐耳清膏抑制裸鼠模型的肿瘤生长 通过观察胃癌细胞MKN-45足垫种植裸鼠模型的肿瘤生长变化来评估槐耳的抗肿瘤效应。对照组足垫瘤RTV增长速率明显高于实验给药组，末次测得槐耳清膏组的足垫瘤RTV为（662.75±450.66）mm3，明显小于空白对照组的RTV（1611.85±611.83）mm3（P＜0.01），见表2。此外，槐耳组裸鼠的活跃度明显好于对照组，而体质量及进食量无明显差异。

表2 两组小鼠建模后足垫瘤相对体积变化（RTV）（±s）

表2 两组小鼠建模后足垫瘤相对体积变化（RTV）（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.01

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3.2 槐耳清膏抑制肿瘤的淋巴结转移 于建模后5周处死裸鼠并解剖腘窝，见图1（插页）；留取腘窝淋巴结组织进行常规病理HE染色检测，判断其转移情况见图2（插页）。腘窝淋巴结转移如表3所示，槐耳组的淋巴结转移率（40%）与对照组（70%）相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 两组小鼠腘窝淋巴结转移情况（只）

3.3 Real-time qPCR测定足垫瘤组织相关mRNA表达 mRNA的表达水平以相对表达量△CT值进行分析，即△CT=CT目的-CT内参。对照组与实验组足垫瘤组织中提取总RNA，通过RT-PCR检测Wnt、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、VEGF的表达。我们发现在给予槐耳清膏灌胃治疗后的足垫肿瘤组织中Wnt、β-catenin、N-cadherin、VEGF的△CT值均高于对照组，而E-cadherin的△CT值低于对照组（P＜0.05），见表4。这些结果表明槐耳清膏可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来阻碍EMT相关进程，进而抑制人胃癌MKN-45细胞的淋巴结转移。

表4 两组小鼠相关mRNA荧光定量△CT值比较（±s）

表4 两组小鼠相关mRNA荧光定量△CT值比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

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4 讨论

槐耳清膏是药用真菌槐耳的提取物，其主要活性成分是多糖蛋白，含多种氨基酸及微量元素，已广泛用于临床的抗肿瘤治疗中，但其确切的机制尚未完全清楚。本实验通过槐耳清膏灌胃方式作用于人胃癌MKN-45细胞的裸鼠模型，检测其种植瘤大小变化及腘窝淋巴结转移情况，本研究发现槐耳清膏可以明显抑制肿瘤细胞在裸鼠上的生长和淋巴结转移，明确其抗肿瘤作用。该实验结果与李立新等[5]所做的槐耳清膏对荷瘤裸鼠肝癌生长及转移的抑制作用一致。

血管生成是肿瘤生长和转移的必要条件[6]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是肿瘤细胞分泌的这一种细胞因子，其通过促进内皮细胞的增殖和迁移及新生血管形成在肿瘤的血管生成和侵袭转移中起着重要作用[7-8]。对组织标本的Real-time qPCR检测结果表明，VEGF的表达明显受到抑制，我们判断槐耳清膏可能通过抑制肿瘤细胞分泌VEGF，进而抑制肿瘤支持血管的生成，限制了肿瘤进一步的生长及转移。

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞来源的恶性肿瘤获得转移和侵袭能力的重要生物学过程[9]。大量研究表明，多种信号通路参与肿瘤的EMT过程，如Wnt、转化生长因子-β（transforming growth factor-β）、Notch信号通路等[10-12]。在肿瘤细胞EMT过程中，紧密连接蛋白ZO-1（zonula occluden-1）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）等上皮标志物表达下调，波形蛋白（vimentin）、N型钙黏蛋白（N-cadherin）等间质标志物表达上调，使上皮来源的肿瘤细胞失去其细胞极性,疏松细胞间的连接，胞内骨架蛋白发生重组。这一系列的改变导致肿瘤细胞的黏附能力下降，进而增加迁移运动能力，使得肿瘤细胞更易于脱离原有位置，发生侵袭或随血行、淋巴等途径转移到体内远隔部位，重新定位于新的器官或组织，最终导致肿瘤的多发转移。本研究表明，经槐耳清膏灌胃治疗后，其腘窝淋巴结转移率存在明显差异，且Real-time qPCR检测表明肿瘤组织中Wnt、β-catenin、N-cadherin这些相关mRNA的表达减少，而E-cadherin增加。当Wnt信号明显受到抑制时，β-catenin无法累积进入核内，从而降低EMT相关靶基因的激活，分别降低N-cadherin和升高E-cadherin的表达，增强细胞之间粘附能力，阻碍肿瘤细胞EMT进程，降低肿瘤的淋巴结转移率。

本研究对于临床出现淋巴结转移胃癌患者应用槐耳治疗提供了一定的依据，但是由于研究中的细胞种类单一，不足以代表所有类型肿瘤的情况，故仍需进一步扩大细胞类型来深入探讨槐耳清膏对不同肿瘤的影响。

总之，槐耳清膏在裸鼠淋巴结转移模型中对人胃癌MKN-45细胞在裸鼠上的生长和转移有明显的抑制作用，且可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路干预EMT相关进程，这些结果都提示槐耳清膏对于出现淋巴结转移的胃癌患者存在一定的疗效。

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（收稿：2015-09-20 修回：2015-10-13）

Trametes Robiniophila Restrains the Growth and Metastasis of Gastric Cancer Cell Line MKN-45 in Mice

ZHANG Yuansu1,CHENG Xiangdong2,XU Zhiyuan2,LV Hang2,DU Yian3,TANG允ia'ning1,LUO Huarong4.1 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of Gastrointestinal Surgery,Zhejiang Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310006),China;3 Department of Abdominal Surgery,Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310022),China;4 Department of Pathology,Zhejiang Taizhou Hospital,Taizhou(317000),China

ObjectiveTo study the effects of trametes robiniophila on the growth and metastasis of human gastric cancer cell MKN-45 in nude mice,and to explore the mechanism.MethodsBALB/c nude mice were inoculated with MKN-45 cells to establish the lymph node metastasis model of human gastric carcinoma.After the model was successfully established,40 mice were randomly divided into control group and trametes robiniophila group（n=20 in each group）.After the mass formed,the caliper was used to measure the tumor size every 5 days. The relative tumor volume（RTV）was calculated.After 5 weeks,the nude mice were killed for determination of Wnt,beta-catenin,N-cadherin,VEGF mRNA expression by Real-time qPCR.ResultsAfter 5 weeks of drugs intervention,the RTV in trametes robiniophila group were less than that in control group（662.75±450.66mm3 vs 1611.85±611.83mm3,P＜0.01）.The lymph node metastasis rate of trametes robiniophila group was 8/20（40%）,lower than that in control group 15/20（75%）（P＜0.05）.Compared with control group,the△CT value of Wnt,β-catenin, N-cadherin,and VEGF in trametes robiniophila groupwere higher（11.36±1.32 vs 9.48±2.07，11.31±1.76 vs 9.37± 1.88，12.82±2.22 vs 7.74±2.64，13.22±1.52 vs 11.04±1.61）,the△CT value of E-cadherin were lower（8.26±2.39 vs 10.64±1.48）,with all P＜0.05.ConclusionTrametes robiniophila can inhibit the growth and lymphatic metastasis of human gastric cancer in nude mice,which might be related with anti-angiogenesis and setting the epithelialmesenchymal transition（EMT）process back.

浙江省中医药重点研究计划（No.2012ZZ002）；浙江省中医药科技计划项目（No.20131279004719）；浙江省中医药科技计划项目（No. 2015ZA090）

1浙江中医药大学研究生院（杭州 310053）；2.浙江省中医院胃肠外科（杭州 310006）；3浙江省肿瘤医院腹部外科（杭州 310022）；4浙江省台州医院病理科（台州 317000）

程向东，Tel：13968032995；E-mail：abcsurg@gmail.com