基于线粒体COⅠ基因序列探讨卵翅蝗亚科系统发育关系

胡 洲，徐吉山，毛本勇

（大理大学农学与生物科学学院，云南大理 671003）

基于线粒体COⅠ基因序列探讨卵翅蝗亚科系统发育关系

胡 洲，徐吉山，毛本勇*

（大理大学农学与生物科学学院，云南大理 671003）

基于线粒体COⅠ基因538 bp片段重建了斑腿蝗科中4亚科（卵翅蝗亚科、稻蝗亚科、禿蝗亚科和黑蝗亚科）10属37种和锥头蝗科1属1种（外群）的系统发育关系。结果显示：（1）4亚科的亲缘关系为（（（卵翅蝗亚科、稻蝗亚科）秃蝗亚科）黑蝗亚科）；（2）卵翅蝗亚科为一个单系群；（3）卵翅蝗属、龙川蝗属的单系性未被支持，但二者均属于卵翅蝗亚科；（4）清水卵翅蝗种团的单系性得到支持，表明清水蝗属并入卵翅蝗属的合理性。

卵翅蝗亚科；系统发育；COI基因；斑腿蝗科；直翅目

卵翅蝗亚科Caryandinae最初由稻蝗亚科Oxyinae中分离出来，以卵翅蝗属Caryanda为模式建立〔1〕；在中国惯用的夏氏分类系统〔2〕中隶于直翅目Orthoptera蝗总科Acridoidea斑腿蝗科Catantopidae下，为斑腿蝗科中的17个亚科之一，其种类主要分布于东洋区，少数分布于非洲区和澳洲区。然而，该亚科的地位一直以来颇有争议，支持〔3-5〕和反对（或怀疑）〔6-10〕的观点并存。在基于Otte分类系统的世界直翅目分类数据库OSF（Orthoptera Species File）〔7〕中，卵翅蝗类和稻蝗类共同被隶于稻蝗亚科Oxyinae稻蝗族Oxyini。

在《中国动物志》中卵翅蝗亚科仅含卵翅蝗属Canyanda和舟形蝗属Lemba〔11〕。毛本勇等〔12〕将龙川蝗属Longchuanacris移入卵翅蝗亚科，Mao等〔13〕将清水蝗属Qinshuiacris并入卵翅蝗属，并建议将清水卵翅蝗、峨山卵翅蝗、白斑卵翅蝗等作为一个种团。至此，卵翅蝗亚科在中国的类群包括卵翅蝗属、龙川蝗属和舟形蝗属。

目前缺乏针对卵翅蝗亚科开展的分子系统学研究，或仅见涉及该亚科个别属的1～2个物种的报道，所以有必要在增加属级单元和物种数量以加大分类单元代表性的基础上，进一步开展分子系统学研究，考查其单系性与否，考查其与近缘亚科稻蝗亚科的系统发育关系，确证其分类地位。

1 材料与方法

1.1实验材料本实验所用蝗虫标本均为无水乙醇浸泡标本，材料取自标本的后足股节。标本的来源见表1，其中涉及6个需要另文发表的新物种。

1.2基因组总DNA的提取本实验的DNA提取采用酚-氯仿-异戊醇法，提取到的DNA加入30～50 μL灭菌水溶解，-20℃保存。

1.3 PCR扩增及测序PCR扩增所用引物为：上游引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’，下游引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-3’，由上海华大生物科技有限公司合成。

扩增体系为：DNA模板3 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、Taq酶1 μL、Buffer 10 μL、DNTP 2 μL、H2O 30 μL。

PCR反应条件：95℃预变性3 min，运行循环：95℃变性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸10 min，25℃保存。个别样品在实验中出现非特异的条带，且经优化条件无法去除，故使用了DNA凝胶回收试剂盒对其进行了纯化，将纯化结果二次PCR后测序。PCR扩增产物和纯化产物交由上海华大生物科技有限公司完成测序。

1.4实验数据的处理和分析序列删除两端信号较差的碱基后，使用ClustalX软件〔14〕进行同源性比对，共得到平均长度为619 bp的数据集，序列采用MEGA4.0〔15〕进行序列组成及饱和度分析，之后采用ML法构建系统发育树。见表1。

表1 样品来源及其COⅠ基因序列GenBank登录号

2 结果与分析

2.1序列数据集特征比对后的38种蝗虫COⅠ数据集序列长度为538 bp，其中一致性位点为383 bp，占整体序列长度的71.1%，变异位点占据整体序列长度的29.9%，处于正常水平，说明该基因种间差异较小，为较为保守的基因。通过对序列分歧度（同一位点的碱基多样性）进行分析，发现这些变异位点分布较为平均，数据集中不存在简约信号位点集中区域，所有的位点均包含系统发育信息，应全部应用于系统树的构建中。

通常，受随机突变作用的影响，昆虫线粒体基因组通常存在明显的碱基偏向性，在复制过程中CT及AG转化非常普遍。在蝗虫中，倾向于AT的突变偏好是其不同物种中独特序列特异性的重要影响因素。本研究中同样发现该现象，数据集中序列整体的GC值为33.8，仅为AT含量的一半。对于各碱基而言，T的碱基含量最高，为33.5%，而G的含量最低，仅为17.3%。碱基特异的方向性突变的发生频率与突变作用的强弱正向关联。分子数据集还包含有更深入的信息有待挖掘。

2.2碱基替换饱和度分析替换饱和是检验一个数据集是否满足建树要求的重要参数。本研究使用F84遗传距离对数据组进行了替换饱和分析，结果表明，转换（同类碱基）与颠换（异类碱基）的比率均随着遗传距离的增加而上升，颠换逐渐多于转换，与线粒体基因中碱基CT及AG突变较多的情况相吻合。转换与颠换的曲线均呈现出向平台期过渡的趋势，即出现饱和状态的倾向。饱和状态一般代表分子标记存在多重替换从而掩盖有效发育信号的现象，但在本研究中，该倾向并不明显，且仅有较少有数据分布于过渡区域的附近，说明实际序列未达到饱和状态，过渡区的表象可能是所选择的物种亲缘关系较近导致序列相似度较高原因所致。整体而言，尽管序列整体上较为保守，但构建的数据集的饱和度在较低的水平上，说明作为常用的分子标记，COⅠ基因包含足够的遗传信息可以用于解析本研究所构建数据集的分类关系。见图1。

2.3系统发育分析利用实验所得COⅠ序列数据集构建的ML树如图2所示。所有物种的分类地位均得到了唯一的解析，获得的ML合意树拥有极高的置信值，说明该树结果可靠。

2.3.1 卵翅蝗亚科与其他3亚科的系统发育关系从ML合意树可以发现，研究所选的4个亲缘关系较近的亚科（卵翅蝗亚科、稻蝗亚科、禿蝗亚科和黑蝗亚科）基本以单一分支方式与外群相连接，外群短额负蝗位于树根基部，说明外群选取合理。就各亚科的位置而言，黑蝗亚科位于最基部，接近外群，为较早分化的类群；其次为秃蝗亚科，再次为稻蝗亚科，卵翅蝗亚科位于树的末端，为较晚分化的类群。卵翅蝗亚科作为一个单系群，与稻蝗亚科的小稻蝗形成姐妹群关系，它们同聚为一支的稻蝗亚科另外4属形成一对姐妹群，其系统发育关系为：（（（（卵翅蝗亚科、小稻蝗）稻蝗亚科）秃蝗亚科）黑蝗亚科），但鉴于本次实验仅涉及COⅠ部分序列，结合形态特征，上述关系可合意为（（（卵翅蝗亚科、稻蝗亚科）秃蝗亚科）黑蝗亚科）。由此可见，卵翅蝗亚科虽然与稻蝗亚科的亲缘关系十分密切，但鉴于其种类没有与其他亚科的种类相互交叉，其单系性是明确的，将卵翅蝗亚科作为一个独立的亚科看待具有合理性。

2.3.2 卵翅蝗亚科所含属、种的系统发育关系 本实验选取了卵翅蝗亚科卵翅蝗属（23种，其中方板卵翅蝗有后足股节绿色、红绿色和红色3种色型）、龙川蝗属（6种）、舟形蝗属（1种）共30种同聚为一支，但卵翅蝗属、龙川蝗属的物种并未分别按属各聚为一簇，尽管这3属的示差特征十分明显，表明这2属的单系性未被支持。也许COⅠ基因序列提供信息量尚不足以揭示其系统发育关系，这有待结合其他基因片段提供的信息联合建树来尝试解析。

图1 序列碱基替换饱和度分析

图2 ML法构建的38种蝗虫的系统树

从ML树还能发现，清水卵翅蝗、峨山卵翅蝗、新平卵翅蝗和白斑卵翅蝗聚为一簇，成为一个单系群。这一结果首次从分子系统学的层面印证了基于形态学将清水蝗属并入卵翅蝗属以及对清水卵翅蝗种团划分的合理性〔13〕。

3 讨论

前人基于形态或分子在解析蝗总科系统发育关系时，涉及了卵翅蝗亚科的地位和单系性问题，支持〔3-5〕和反对（或怀疑）〔6-10〕的观点并存，但取样量小，目前已登录的有效的基因序列仅10条，相关研究也仅涉及该亚科个别属的1～2个物种。本文针对该亚科的分子系统学研究取样量大，具有广泛的代表性，实验结果说明的问题应该更加接近实际情况。本研究目前已经向GenBank提交清水卵翅蝗的COⅠ基因序列（KT998894），尚有29个本亚科物种的COⅠ基因序列在陆续提交中，其中有关龙川蝗与舟形蝗属的COⅠ基因序列为首次提交，这为解析卵翅蝗亚科各物种的分类关系提供了有效数据。

前人针对卵翅蝗亚科的形态学的研究已经相当深入，近年来更多研究涉及种团的划分〔16-18〕，但有关其分子系统学的研究则极少。虽然COⅠ是有效的系统发育基因，然而单纯使用线粒体基因构建的系统发育树在缺乏足够的近缘物种的情况下很可能受吸附效应的影响而出现相互连接的现象。未来对于卵翅蝗亚科的进化分析应重视使用全线粒体基因组，乃至添加核基因信息，进行综合分析来加以评判。

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Phylogenetic Relationships of Caryandinae based on Mitochondrial COI Gene Sequences

Hu Zhou,Xu Jishan,Mao Benyong*
（College of Agriculture and Biology Science,Dali University,Dali,Yunnan 671003,China）

With the species Atractomorpha sinensis as an outgroup,the phylogenetic relationships of 37 species belonging to 10 genera from 4 subfamilies（Caryandinae,Oxyinae,Podisminae and Melanoplinae）of Catantopidae were reconstructed based on COⅠgene 538 bp sequence data.The results suggested that:1）the phylogenetic relationships among 4 subfamilies can be expressed as（（（Caryandinae,Oxyinae）Podisminae）Melanoplinae）;2）Caryandinae was supported as a monophyletic group;3）the monophyly of Canyanda and Longchuanacris can not be supported,but the two belong to the Caryandinae;4）the monophyly of C.viridis species group was supported which indicated the rationality of merging the Qinshuiacris into the Caryanda genus.

Caryandinae;phylogenetic;COⅠgene;Catantopidae;Orthoptera

Q96

A

2096-2266（2016）12-0057-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2016.12.014

（责任编辑 李 杨）

国家自然科学基金资助项目（31260520；31560605）

2016-10-24

2016-10-27

胡洲，助理实验师，主要从事昆虫分子生物系统学研究. *通信作者：毛本勇，教授，博士.