鸡传染性支气管炎病毒M41株种毒的冻干鉴定

张敏，蒋桃珍，王静文，张兵，陈玲

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

鸡传染性支气管炎病毒M41株种毒的冻干鉴定

张敏，蒋桃珍，王静文，张兵，陈玲

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

为制备合格的鸡传染性支气管炎病毒M41株种毒，将M41株毒种接种SPF鸡胚进行传代培养，收获尿囊液、分装、冻干，并对冻干毒进行了无菌检验、支原体检验、剩余水分测定、真空度测定、外源病毒检验、病毒含量测定、特异性检验、致病性试验。结果表明，该冻干毒种各项检验均符合规定，可作为研究用种毒。本研究可为其他禽源病毒种毒的制备提供借鉴。

鸡传染性支气管炎病毒；冻干；鉴定

鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病，以气管啰音、咳嗽、打喷嚏，幼鸡流鼻涕，产蛋鸡产蛋量减少和蛋的品质下降为特征，常因呼吸道、肾脏或消化道感染而引起死亡，本病至今在世界范围内广泛流行，给养鸡业带来严重危害[1-3]。疫苗免疫是当前预防和控制IB的主要措施[4-7]，IBV M41株不仅用作疫苗制备[8]，而且是《中华人民共和国兽药典》中规定的疫苗效力检验攻毒用标准强毒株[9]。本实验对中国兽医微生物菌种保藏中心的IBV M41株进行了扩繁、冻干，并对冻干毒进行了一系列鉴定工作包括性状、无菌检验、支原体检验、剩余水分测定、真空度测定、外源病毒检验、病毒含量测定、特异性检验和致病性试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 IBV M41种毒 CVCC编号为AV1511，购自中国兽医药品监察所，置-70 ℃冰箱保存备用。

1.1.2 实验动物 SPF鸡、SPF鸡胚均购自北京梅里亚维通动物技术有限公司。

1.1.3 其他材料及试剂 IBV特异性阳性血清、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、鸡REV特异性抗体、禽白血病病毒(RAV1、RAV2)，中国兽医药品监察所；5%蔗糖牛奶、无菌培养基、支原体培养基，中海动物保健科技公司；MEM、胎牛血清，Hyclon公司；禽白血病病毒ELISA试剂盒，IDEXX公司;FITC标记的兔抗鸡IgG，sigma公司。

1.2 方法1.2.1 毒种繁殖 将IBV M41种毒用生理盐水10倍稀释后尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚，0.1 mL/枚，37 ℃孵育，每日照蛋，24 h前死胚弃去，24 h后的死胚及时放置于4 ℃冰箱保存。收获36 h鸡胚尿囊液，无菌检验合格后作为冻干用毒液，置-70 ℃冰箱保存。

1.2.2 毒种冻干 将病毒尿囊液与无菌检验合格的5%蔗糖脱脂牛奶等量混合，分装于安瓿瓶中，每支1 mL，含病毒0.5 mL，分装好后立即置于冻干机中冻干，冻干程序为：-40 ℃150 min；-10 ℃660 min；26 ℃ 540 min。冻干结束后将安瓿二次抽真空封口，置-70 ℃冰箱中保存待检。

1.2.3 毒种鉴定

1.2.3.1 常规检验 冻干后毒种按《中华人民共和国兽药典》抽样进行鉴定：性状检验应为淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解；无菌检验应无细菌生长；支原体检验应无支原体生长；剩余水分测定和真空度测定应符合规定；外源病毒检验应无外源病毒污染。

1.2.3.2 病毒含量测定 抽取待检样品用生理盐水复溶至原体积，然后10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释度各接种5枚9日龄SPF鸡胚，每枚0.1 mL，同时设生理盐水对照组，置37 ℃培养箱中孵育144 h，每天照蛋，弃去24 h死亡鸡胚，记录24 h后的死胚和鸡胚有胎儿发育小、蜷缩等病变数。按Reed-Muench法计算EID50。

1.2.3.3 特异性检验 抽取待检样品，用灭菌生理盐水稀释至200 EID50/0.1 mL, 取1.5 mL与等体积的鸡传染性支气管炎病毒特异性阳性血清混合，室温作用1 h(期间振摇1次)，经尿囊腔接种10枚9日龄SPF鸡胚，每胚0.2 mL，同时设置病毒对照组和生理盐水对照组。37 ℃孵育，24 h死亡鸡胚弃去不计，观察24～144 h鸡胚存活和胚胎发育情况[8-9]。

1.2.3.4 致病性试验 取冻干毒1支，用生理盐水做10倍稀释后滴鼻、点眼6日龄SPF鸡20只，每只0.2 mL，设生理盐水对照鸡10只，每只鸡同法接种生理盐水。所有鸡接种后观察14 d，记录死亡情况和出现甩头、伸颈、呼吸困难、流鼻涕等传染性支气管炎典型症状的情况[8-9]。

2 结果

2.1 性状检验 冻干后病毒呈淡黄色海绵状疏松团块(图1)，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

图1 IBV M41冻干毒株

2.2 无菌检验 经25 ℃ TG、GA、GP三种培养基和37 ℃ TG、GA两种培养基检测发现，IBV M41冻干毒无细菌生长，检验合格。

2.3 支原体检验 由表1可以看出，IBV M41冻干毒无支原体生长，检验合格。

表1 支原体检验结果

“-”表示无支原体生长；“+”表示有支原体生长

2.4 剩余水分测定 由表2可以看出，IBV M41冻干毒剩余水分符合规定。

2.5 真空度测定 使用高频火花真空测定器对冻干毒种进行测定，出现白色、粉色或紫色辉光的判为合格，真空合格的毒种为216支。2.6 外源病毒检验 鸡胚检查法尿囊腔和绒毛尿囊膜两种途径接种后胎儿发育正常，绒毛尿囊膜无病变，鸡胚液血凝试验结果为阴性;禽白血病病毒检查结果(表3)和禽网状内皮组织增生症病毒检查结果(图2)也均为阴性，说明该冻干毒无外源病毒污染。

表2 剩余水分测定结果

表3 禽白血病病毒检查ELISA试验结果

S/P值≤0.2判为阴性，S/P值>0.2判为阳性

图2 网状内皮组织增生症病毒检查结果

2.7 病毒含量测定 结果见表4。IBV M41冻干毒对鸡胚的半数感染量为105.9/0.1mL，符合要求。

表4 病毒含量测定结果

2.8 特异性检验 结果见表5。可以看出，IBV M41冻干毒的特异性检验符合要求。

表5 特异性检验结果

2.9 致病性试验 由表6结果可见，该病毒从第2天起就能引起6日龄SPF鸡出现传染性支气管炎临床症状，发病症状明显、特异，发病时间集中在第2～7天，至观察结束，能引起鸡群100%发病。

表6 致病性试验结果

3 讨论与小结

冻干后保存是菌毒种最有效的保存方法，保存年限可达15～20年，甚至更长,原理就是使菌毒种在安瓿中冷冻，然后在真空下利用升华现象除去水分，使其处于干燥、缺氧状态，生理活动停止，在4 ℃即可保存，并且方便存取、运输、销售和交换。未经冻干的湿毒即使在超低温冰箱中保存也存在毒力下降的风险，且不适合运输，因此很多微生物菌种保藏中心对菌毒种的保藏一般采用冻干保存[10]。

冻干后鉴定是菌毒种保藏前重要的步骤，鉴定不合格的不能作为种毒保存。鉴定不仅要对菌毒种本身特性进行鉴定，也要对其纯净性和冻干后性状进行判定。本研究对传染性支气管炎病毒M41株进行鸡胚传代扩繁后冻干，抽取样品，经病毒含量测定、纯净性、特异性、致病性、性状、真空度、剩余水分等鉴定证明，该病毒传代稳定，病毒含量达到要求；无细菌、支原体和外源病毒污染；能够被同型特异性阳性血清中和；能引起雏鸡100%发病；冻干后性状、真空度和剩余水分都能达到要求，可以作为研究用种毒。

[1] 童光志.动物传染病学[M].北京:中国农业出版社,2008.

[2] Saif Y M , Bames H J , Glisson J R,etal.Diseases of poultry[M].11th.Ames:Iow a State University Press, 2003.

[3] Cavanagh D. Coronavirus avian infectious bronchitis virus[J]. Veterinary Research, 2007,38(2):281-297.

[4] Bijlenga G，Cook J K，Gelb J Jr，etal. Development and use of the H strain of avian infectious bronchitis virus from theNetherlands as a vaccine[J]. Avian Pathol，2004，33(6)：550-557.

[5] 陶家权,刘乔然,乔荣芩,等.鸡传染性支气管炎的流行及防控[J].中国家禽,2009,31(24) : 65-66.

[6] 代金芳.鸡传染性支气管炎疫苗使用概况[J].畜禽业,2014,12(308):14-15.

[7] 李英芳.鸡传染性支气管炎流行现状及其防控措施[J].畜牧兽医杂志,2015,34(4):88-89.

[8] 农业部兽药评审中心.兽药质量标准汇编[S].2011.

[9] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[S].2010年版三部.

[10]华泽钊.冷冻干燥新技术[M].北京：科学出版社,2006.

(编辑：李文平)

Lyophilization and Identification of Chicken Infectious Bronchitis Virus M41 Strain Seeds

ZHANG Min，JIANG Tao-zhen，WANG Jing-wen，ZHANG Bing，CHEN Ling

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

For the preparation of qualified chicken infectious bronchitis virus M41 strain seeds, M41 strain seeds were inoculated on SPF chicken embryo for subculture. Allantoic fluid was harvested, repackaged andlyophilizated, thensubsequent identification were conducted including the sterility test, mycoplasma test, determination of residual moisture, vacuum degree, exogenous virus test, virus content determination, specific identification and pathogenicity test. All the results show that lyophilizatedseedsmeet the demand of regulation and can be employed for research. This research provides the reference for the preparation of other typespoultry virus of seeds.

chicken infectious bronchitis virus；lyophilization；identification

张敏，硕士，从事动物细胞及病毒方面的研究。E-mail：zmbooksea@163.com

2016-07-05

A

1002-1280 (2016) 08-0005-04

S852.65