猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验

车勇良，陈如敬，吴学敏，王晨燕，王隆柏，刘玉涛，周伦江

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013）

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验

车勇良，陈如敬，吴学敏，王晨燕，王隆柏，刘玉涛，周伦江

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013）

福建省某猪场猪出现呼吸困难、气喘和咳嗽，病死猪肺脏有纤维素性胸膜肺炎病变，从病变肺脏中分离出一株革兰氏阴性短小球杆菌，生化试验表明，该菌能发酵木糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖。经PCR扩增、克隆和测序确定该菌为猪胸膜肺炎放线杆菌。动物试验表明，该菌对小鼠具有致病性。药敏试验显示，该分离菌株只对阿莫西林、头孢噻肟和青霉素这3种药物敏感，而对氟苯尼考、替米考星、四环素、链霉素、强力霉素、环丙沙星、林可霉素、壮观霉素和磺胺嘧啶钠呈现耐药现象。该研究为猪场用药提供了参考依据。

猪胸膜肺炎放线杆菌；分离；鉴定；药敏试验

猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropeumoniae,APP）引起的猪的一种高度接触性传染性呼吸道疾病，主要特征是急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎[1]。该病多为继发，其发生多与细菌的毒力、猪体的健康状况及猪舍卫生条件等因素密切相关。自1957年首次报道以来，该病已在欧美、日本、中国等全世界范围广泛传播[2]。我国自从1987年发现该病以来，该病在我国各个省份有愈演愈烈之势，尤其是近几年来，随着我国猪场规模化、集约化的发展，猪传染性胸膜肺炎的发病率和死亡率呈现明显上升趋势，给我国养猪业造成巨大的经济损失[3]。

根据APP生长是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），分为两个生物型，即生物Ⅰ型（NAD依赖菌株）和生物Ⅱ型（非NAD依赖型）[4]，根据APP表面荚膜多糖和脂多糖抗原性的不同，又分为15个血清型，生物Ⅰ型包括血清型1～12型和15型，生物Ⅱ型包括13型和14型。各血清型之间的交叉保护性不强，其中1、4和6型之间及3、6和8型之间有较好的交叉反应[5]。

本研究对福建省某猪场采集的疑似病猪肺脏进行了细菌分离培养及鉴定，通过药敏试验，筛选出高敏药物，为猪场临床治疗提供了参考。

1 材料与方法

1.1 病料采集

病料于2015年5月20日采集自福建省某猪场。哺乳仔猪在20日龄左右开始出现呼吸困难、打喷嚏、咳嗽和消瘦等临床症状，哺乳仔猪断奶成活率为70%，保育猪成活率也为70%，肥育猪成活率为80%。剖检病变显现为出血性肺炎、胸膜炎和心包炎，支气管和气管内分泌物增多。

1.2 试验材料

胰酶大豆琼脂培养基（TSA）和胰酶大豆肉汤培养基（TSB）均购自BD Difco公司，小牛血清从杭州四季青公司购得，金黄色葡萄球菌由福建省农科院畜牧兽医研究所猪病研究室保存，NAD购自Roche公司，分子生物学试剂pMD18-T质粒载体、Taq酶和DNA Marker均购自TaKaRa公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌分离与纯化 用火焰灭菌的接种针挑取病猪肺脏，划线接种于TSA培养板，并在接种线的垂直方向划线接种金黄色葡萄球菌，放置于37℃恒温箱中培养24～48 h后，观察菌落形态并挑取可疑菌落进行革兰氏染色镜检。并将可疑单菌落接种于TSA培养基进行纯化培养，直至菌落形态大小均一、色泽一致为止。

1.3.2 生化试验 使用微生物生化管进行生化鉴定，包括尿素酶接触试验、溶血性试验、过氧化氢试验、卫星现象等，糖发酵反应试验包括：木糖、甘露醇、棉子糖、阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖等。

1.3.3 细菌基因组DNA提取 挑取纯化后的单个菌落接种于含5%小牛血清和0.005%NAD的TSB液体培养液中，37℃振荡培养过夜。离心沉淀后加入PBS重悬，按照分子克隆2[6]的CTAB/NaCl方法提取细菌基因组DNA，自然干燥后溶于TE中-20℃保存备用。

1.3.4 细菌16S rRNA的PCR扩增 根据GenBank中胸膜肺炎放线杆菌的16S rRNA序列设计1对特异性引物，上游引物AP1：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，下游引物AP2：5'-GGTACCTTGTTACGACTT-3'。以提取的细菌基因组DNA为模板，采用特异性引物AP1/AP2进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5 min、94℃变性40 s、52℃复性40 s、72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。100 V、1%琼脂糖电泳40 min，凝胶成像系统观察结果。

1.3.5 DNA序列测定 通过电泳回收PCR产物，回收纯化后的产物送公司测序。

1.3.6 16S rRNA基因序列分析 应用DNAMAN分析软件对分离的细菌16S rRNA序列与GenBank中公布的不同血清型菌株16S rRNA序列进行同源性比较分析。

1.3.7 动物试验 选取10只8周龄Balb/c小鼠分为2组，一组将纯培养的细菌液（计数为1.5×108cfu/mL）注射小鼠腹腔，0.5 mL/只，共注射5只。另外一组作为对照组，注射培养基，0.5 mL/只，共注射5只。攻毒后连续观察10 d，计算小鼠死亡情况。

1.3.8 药敏试验 用接种针挑取分离的细菌涂布于TSA培养板中，选择药敏纸片粘贴于培养基上，放置于37℃培养箱培养24 h，观察并测定抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 胸膜肺炎放线杆菌的分离纯化与菌落形态特征

从病猪肺脏中分离出一株细菌，菌落在TSA血平板上呈灰白色、半透明、表面光滑、湿润的圆形小菌落。在葡萄球菌附近形成“卫星状”生长，且离葡萄球菌越近，生长的菌落越多；反之，离葡萄球菌越远，生长的菌落越少。细菌经革兰氏染色后为革兰氏阴性，呈细小短杆状，少数为长丝状。细菌传代培养时在鲜血TSA琼脂平板上生长良好，在巧克力琼脂平板上生长快速，在普通肉汤琼脂平板上不生长。

2.2 生化试验结果

通过观察发现，胸膜肺炎放线杆菌的尿素酶、过氧化氢酶呈现阳性，可以分解木糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、果糖和葡萄糖，但不能分解棉子糖和阿拉伯糖。

2.3 PCR分析结果

分离细菌经PCR扩增，电泳结果显示目的片段在1 402 bp左右（图1），凝胶回收试剂盒回收纯化该片段。

图1 胸膜肺炎放线杆菌16S rRNA基因的PCR结果

2.4 16S rRNA测序及同源性分析

回收PCR目的片段送测序公司测序，应用DNAMAN软件对所测序列与GenBank上公布的胸膜肺炎放线杆菌16S rRNA序列进行同源性分析，结果显示分离细菌与GenBank中公布的胸膜肺炎放线杆菌16S rRNA序列同源性在99%以上（表1）。

表1 细菌16S rRNA基因序列同源性比较

2.5 动物试验结果

小鼠腹腔攻毒后24 h内，攻毒小鼠5只全部死亡，而对照组未出现死亡。表明该细菌对小白鼠有致病性。

2.6 药敏试验结果

用直尺测量各药敏纸片的抑菌圈直径，分析对分离细菌的敏感药物（表2）。

表2 药敏试验结果

3 讨论

近年来，猪传染性胸膜肺炎在全世界范围广泛流行，给养猪业造成了巨大的经济损失[7-8]。病猪常表现为精神沉郁、呼吸困难、气喘和咳嗽，鼻腔流出泡沫或血性泡沫，通常2～4 d后死亡。剖检主要表现为纤维素性肺炎、肺脏出血、胸腔积液或肺脏局部坏死。本研究动物试验表明，该分离细菌对小鼠具有较强的致病性。本研究采集疑似病猪肺脏，对其细菌进行分离并进行了PCR、克隆和测序，测序结果与GenBank中已登录的猪胸膜肺炎放线杆菌进行同源性比对，同源性均达到99%～100%。

APP感染后，很难从猪场根除，在患病早期用抗生素治疗有效，但长期用药容易导致耐药性的产生[9]。本研究药敏试验结果表明，APP出现了多重耐药，对强力霉素、替米考星、氟苯尼考、林可霉素、壮观霉素、环丙沙星、四环素、链霉素和磺胺嘧啶钠表现为耐药，敏感的药物只有阿莫西林、青霉素和头孢噻肟。多重耐药菌株的出现给猪传染性胸膜肺炎的防治带来了困难，这也是临床难治愈的根本原因之一。而且，因为APP血清型众多，市场上也没有一种疫苗可防治所有血清型菌株引起的疾病，所以有必要对发病猪场进行细菌分离鉴定和药敏试验，有针对性的指导临床用药。

[1]斯劳特，阿莱尔，蒙加林，等.赵德明，张中秋，沈建忠，译.猪病学[M].第9版.北京：中国农业大学出版社，2008.

[2]姚建聪，何启盖，王娟，等.猪传染性胸膜肺炎诊断方法研究进展[J].动物医学进展，2003，24（2）：41-44.

[3]余燕，马金友，王天有，等.猪接触传染性胸膜肺炎的诊治[J].河南农业科学，2007（8）：107-108.

[4]厚华艳，梁武，吕茂杰，等.猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗研究进展[J].动物医学进展，2015，36（2）：84-88.

[5]Grasteau A,Tremblay Y D,Labrie J,et al.Novel genes associated with biofilm formation of Actinobacillus pleuropneumoniae[J]. Vet Microbiol,2011,153(1-2):134-143.

[6]萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T.金冬雁，黎孟枫，侯云德，等译.分子克隆实验指南[M].第2版.北京：科学出版社，1999：125-126.

[7]Nielsen R,Danielsen V.An outbreak of Glasser's disease. Studies on etiology,serology and the effect of vaccination[J]. Nord Vet Med,1975,27(1):20-25.

[8]达来宝力格.胸膜肺炎放线杆菌生物被摸突变体的筛选与生物学特性的研究[D].武汉：华中农业大学，2008.

[9]Klinkenberg D,Tobias T J,Bouma A,et al.Simulation study of the mechanisms underlying outbreaks of clinical disease caused by Actinobacillus pleuropneumoniae in finishing pigs[J].Vet J, 2014,202(1):99-105.

（编辑：柳青）

污染物进入大脑或致痴呆症

【英国《每日电讯报》网站9月5日报道】题：在人脑中发现了与阿尔茨海默症有关的“空气污染”微粒

科学家们警告说，汽车引擎和刹车产生的磁性微粒可进入人的大脑，进而可能引发阿尔茨海默症。

兰开斯特大学、牛津大学和曼彻斯特大学的研究人员，对曼彻斯特和墨西哥患有神经组织退化疾病的37名患者的大脑进行了检查，发现了球状磁铁矿微粒。

这种磁性微粒是已知的有毒物质，与自由基的产生有关，而自由基又与阿尔茨海默症有关。

虽然以前在死于阿尔茨海默症的患者大脑中发现过磁铁矿，但当时认为它是天然产生的。然而，科学家们发现的这种球状微粒有一个熔融表面，证明它们是在极热时形成的，比如在汽车引擎中形成的。

磁铁矿（铁的一种氧化物）已知是在汽车引擎中产生的—特别是柴油机，其微粒的排放量是汽油机的22倍多。当刹车时，汽车和火车都会产生这种微粒。明火和质量不好的炉子也会产生这种磁性微粒。

研究人员说，这一发现为找到阿尔茨海默症的病因打开了一个“全新的途径”。而慈善机构说，这为有毒粒子可能进入大脑的说法提供了“令人信服的证据”。

这项研究的第一作者、兰开斯特大学教授芭芭拉·马厄说：“我们的研究结果表明，大气中的磁铁矿的纳米粒子能进入人类大脑，可能会对人类健康构成风险，包括罹患阿尔茨海默症等。”

“我们发现的微粒与城市空气污染物、尤其是繁忙道路附近的空气污染物中大量存在的磁铁矿纳米微粒球惊人地相似，后者是汽车引擎内燃或刹车摩擦生热形成的。”

兰开斯特大学教授、阿尔茨海默症研究专家戴维·艾尔索普表示：“这一发现为研究可能造成一系列脑病的环境风险因素提供了一个全新途径。”

英国约有80万人患有痴呆症，其中多数为阿尔茨海默症，而随着人口老化，这一数字估计还将增加。

已知空气污染与肺病和心脏病有关，而最近的研究表明，空气污染可能也是造成认知衰退的一个因素。美国2014年的一个研究报告证明，高度污染地区的人们脑力衰退的可能性增加50%。

不过，此前没有人认为那些微粒会进入大脑。这个新的研究表明，微粒可以被吸入体内并通过嗅神经进入大脑。嗅神经负责将气味信息带给大脑。

（转自参考消息[N]，2016-09-09）

S858.285.1

A

1002-1957(2016)06-0102-03

2016-09-19

福建省公益类科研专项（2010R1025-2）；福建省生猪产业体系

车勇良（1976-），男，江西临川人，副研究员，主要从事预防兽医学研究.E-mail：cyl19760810@163.com

周伦江（1973-），男，福建周宁人，研究员，博士，主要从事畜禽传染病防控研究.E-mail：lunjiang@163.com