酵母SOD1基因缺失突变体应答真菌细胞壁抑制剂CFW的转录组学分析

张小华，刘向勇，卞伟华，徐岩艳，许 聪

(滨州医学院 药学院，山东 烟台 264003)

酵母SOD1基因缺失突变体应答真菌细胞壁抑制剂CFW的转录组学分析

张小华，刘向勇*，卞伟华，徐岩艳，许 聪

(滨州医学院 药学院，山东 烟台 264003)

以酿酒酵母为研究材料，采用酵母全基因组表达谱芯片，分析超氧化物歧化酶SOD1基因缺失(sod1Δ)对酵母细胞应答真菌细胞壁抑制剂钙荧光白(CFW)全基因组转录表达谱的影响，为揭示植物病原真菌细胞壁调控机制以及植物抗真菌基因工程改造提供新的理论基础。结果表明：CFW (10 μg/mL) 处理1 h后，与野生型酵母细胞相比，sod1Δ酵母细胞中211个基因发生了显著差异表达(97个基因表达上调、114个基因表达下调)。随机选取5个差异表达基因采用定量PCR验证，结果与芯片分析结果一致。差异表达基因功能主要涉及细胞壁、细胞代谢、蛋白质合成、细胞防御以及大量功能未知蛋白。以上结果表明,SOD1基因缺失可显著改变酵母细胞应答真菌细胞壁抑制剂CFW胁迫的全基因组转录表达谱。

真菌细胞壁抑制剂； 钙荧光白； 酿酒酵母； DNA芯片； 细胞壁; 超氧化物歧化酶

真菌是导致植物病害最重要的病原菌，已知的植物病原真菌有8 000种以上，可引起3万余种植物病害，约占全部植物病害的80%以上。真菌病害对农作物危害极大，可导致作物正常的组织和器官遭到破坏，引发作物表现出各种病态甚至死亡，此外,其传播速度快、侵染范围广，从而造成大范围农作物减产降质，给农业生产带来巨大损失[1-4]。深入开展真菌基础生物学研究，对加快植物真菌病害防治研究，促进农业经济发展具有重要的基础理论意义。

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是真菌酵母菌属中的典型菌种，易于培养，遗传背景清楚，分子遗传操作体系完善，同时在细胞结构(例如细胞壁)、信号转导通路、生化代谢途径、基因调控等方面与已知植物病原真菌具有较高的同源性，为了解植物病原真菌相关的生物学机制提供了便捷的研究模式材料[5-6]。

细胞壁是真菌重要的亚细胞结构，在维持细胞形态、细胞物质运输、细胞增殖、细胞防御等方面发挥重要作用。真菌细胞壁是抗真菌农用抗生素的重要药物作用靶点和植物抗真菌基因工程中理想的抗菌靶位。酿酒酵母细胞壁主要成分包括几丁质、葡聚糖、甘露糖蛋白等，它们之间相互交联形成一种韧性结构[7]。真菌细胞壁抑制剂钙荧光白(Calcofluor white, CFW) 通过与酵母细胞壁中几丁质发生特异性结合，破坏细胞壁的正常组装，产生细胞壁胁迫，抑制菌体正常生长[8-9]。SOD1基因编码的铜锌超氧化物歧化酶是酵母细胞中最重要的抗氧化酶，可把有害的超氧自由基转化为过氧化氢和氧气。前期研究发现，SOD1基因缺失(sod1Δ)导致酵母细胞对真菌细胞壁几丁质特异性结合抑制剂CFW的敏感性增加，提示真菌细胞壁对抑制剂的耐受性与细胞抗氧化能力改变相关[10]。本研究以酿酒酵母为研究材料，采用酵母全基因组表达谱芯片，研究SOD1基因缺失对酵母细胞应答真菌细胞壁抑制剂CFW全基因组转录表达谱的影响，进一步解析真菌细胞壁对抑制剂的耐受性与细胞抗氧化能力之间的关系，为全面揭示植物病原真菌细胞壁调控机制以及植物抗真菌基因工程改造提供新的理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试野生型酿酒酵母BY4741菌株(MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) 由日本酵母遗传中心提供。酿酒酵母sod1Δ菌株(sod1::kanMX4) 购自Thermo Scientific (Waltham, MA)公司。

酿酒酵母常规培养采用YPD培养基：葡萄糖 20 g、蛋白胨10 g、酵母粉10 g，加蒸馏水至1 000 mL，分装，pH值6.0～6.5, 115 ℃ 30 min灭菌。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母CFW胁迫处理 接种酿酒酵母(BY4741 和sod1Δ) 单菌落至10 mL的YPD液体培养基中，30 ℃摇床培养过夜。离心收集过夜培养物，转接至含有50 mL YPD液体培养基的250 mL三角瓶中，菌体起始含量为OD600=0.1。继续培养至酵母细胞进入对数生长期(OD600=0.6～0.7)，在培养物中添加33.4 μL质量浓度为15 mg/mL 的CFW母液(至CFW终质量浓度为10 μg/mL)，30 ℃摇床培养1 h，离心收集菌体。

1.2.2 酵母全基因组表达谱芯片分析 使用Trizol试剂(Invitrogen 公司，美国)提取酿酒酵母总RNA, 并通过NucleoSpin®RNA clean-up 试剂盒(Marcherey-nagel, 德国)纯化。分别采用甲醛变性胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA完整性和浓度。采用Jingxin®cRNA amplification and labelling kit(博奥生物公司, 中国)进行cDNA合成和标记。芯片杂交使用7K Yeast Genome Array(博奥生物公司, 中国)，之后采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进行芯片扫描。采用GenePix Pro 4.0 图像分析软件(Axon Instruments公司，美国)对芯片图像进行分析，计算ratio值；芯片数据经Lowess方法归一化后，用T-test和以2倍差异(即ratio值大于等于2.0，小于等于0.5)标准来确定差异表达基因。采用MIPS Functional Catalogue Database(http://mips.helmholtz-muenchen.de/funcatDB/)[11]和SaccharomycesGenome Database(SGD, http://www.yeastgenome.org)对所选差异表达基因进行功能聚类分析。

1.2.3 实时定量RT-PCR验证 酵母总RNA经RNA free DNaseⅠ(宝生物公司，中国)处理后，采用MMLV reverse transcriptase (Promega, 美国)反转录合成cDNA。以cDNA为模板，采用SYBR Green Ⅰ 荧光染料检测法，在ABI PRISM7900 PCR仪(Applied Biosystems公司，美国)中进行实时荧光定量PCR扩增。以看家基因ACT1为内参，PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。相对表达变化倍数采用2-ΔΔCt法分析[12]。实时荧光定量PCR所用引物见表1。

表1 实时荧光定量PCR所用引物

2 结果与分析

2.1 酵母总RNA的提取

分别提取真菌细胞壁抑制剂CFW处理后野生型酵母菌株BY4741和sod1Δ菌株的总RNA，过柱纯化后，甲醛变性胶电泳检测完整性，如图1显示，28S rRNA和18S rRNA条带清晰、明亮，浓度比接近1∶1，提示RNA 完整性良好，无明显降解。紫外分光光度计检测表明，CFW处理的野生型酵母菌株BY4741 总RNA OD260/OD280=1.92，sod1Δ菌株总RNA OD260/OD280=2.05, 质量符合表达谱芯片分析要求。

2.2 野生型菌株与sod1Δ菌株在CFW胁迫下转录表达谱分析

基因芯片数据分析显示，经10 μg/mL CFW 处理1 h后，与野生型菌株相比，sod1Δ菌株全基因组

表达谱发生明显改变，211个基因差异表达，其中，表达上调基因97个，下调基因114个(表2)。进一步利用MIPS Functional Catalogue Database和SaccharomycesGenome Database对所选差异表达基因进行功能聚类分析。

1：CFW处理后野生型酵母菌株BY4741总RNA;2:CFW处理后sod1Δ菌株总RNA

表2 CFW胁迫条件下sod1Δ菌株与野生型菌株差异表达基因统计

2.2.1 表达上调差异基因 如图2所示，表达上调差异基因功能主要涉及细胞组件(22个)、细胞防御(13个)、细胞代谢(17个)及功能未知蛋白(15个)。细胞组件功能分类中9个基因与细胞壁相关，其中包括几丁质合成酶Ⅰ基因 (CHS1)、几丁质合成酶Ⅲ基因(CHS3)、几丁质合成酶Ⅲ激活因子基因(SKT5)、几丁质转糖基酶基因(CRH1) 等细胞壁几丁质相关基因，细胞壁蛋白相关基因(PIR1、CCW14和PST1)，β-葡聚糖合成相关基因KRE6和KRE11。该结果表明，SOD1基因缺失可以影响酵母细胞应答CFW胁迫中细胞壁相关基因的表达。

细胞防御功能分类中涉及已报道在多种胁迫条件下对细胞发挥保护作用的海藻糖合成基因(TPS3、TPS1)[13]、热冲击蛋白基因(HSP104)[14]和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GSH1)[15]。以上基因上调表达，将有利于sod1Δ酵母细胞应答CFW引发的细胞壁胁迫。

2.2.2 表达下调差异基因 如图2所示，表达下调差异基因功能主要涉及细胞代谢(12个)、蛋白质命运(11个)、蛋白质合成(19个)及功能未知蛋白(29个)。蛋白质合成功能分类中包含大量核糖体相关基因：RPS31、MRPS5、RPS4A、RPS28B、MRPL50、RPP2A、RPS19A、RPS28A、MRPS16。核糖体基因表达的大规模下调，将有利于sod1Δ酵母细胞节约更多的生物质和能量[16]，应急表达抵抗CFW胁迫的相关蛋白质，以适应外界环境变化。

图2 CFW胁迫条件下sod1Δ菌株与野生型菌株差异表达基因功能分类

2.3 实时荧光定量PCR验证

随机选取5个差异表达基因(ERV2、PAM18、PHA2、MSH5、UPC2)，以看家基因ACT1为内参，采用实时荧光定量PCR对芯片分析结果进行验证。如表3所示，实时荧光定量PCR结果与芯片分析结果一致。

表3 实时荧光定量PCR验证

3 结论与讨论

真菌侵染性病害是引发农作物减产降质的重要因素之一，其防治相关的基础和应用研究一直备受关注。几丁质是真菌细胞壁的重要组分之一，由N-乙酰葡糖胺通过β-1, 4-糖苷键聚合而成，与其他细胞壁组分相互交联，形成具有一定韧性的结构，为细胞提供机械支撑和保护[17]。由于植物不含几丁质，所以其成为抗真菌农用抗生素筛选开发和植物抗真菌基因工程中理想的抗菌靶位[18-19]。本研究通过酵母全基因组表达谱芯片研究发现，真菌细胞壁几丁质特异性结合抑制剂CFW处理(10 μg/mL，1 h)后，与野生型酵母细胞相比，sod1Δ酵母细胞中211个基因发生了显著差异表达(97个基因表达上调、114个基因表达下调)。随机选取5个差异表达基因采用定量PCR验证，结果与芯片分析结果一致。差异表达基因功能主要涉及细胞壁、细胞代谢、蛋白质合成、细胞防御以及大量功能未知蛋白。以上结果表明，SOD1基因缺失可显著改变酵母细胞应答真菌细胞壁抑制剂CFW胁迫的全基因组转录表达谱，为揭示植物病原真菌细胞壁调控机制以及植物抗真菌基因工程改造提供新的理论基础。

此外，在所筛选的差异表达(上调/下调)基因中，功能未知基因总数达到44个，占差异表达基因总数的21%，解析这些基因的功能，将为深入揭示真菌细胞壁调控机制提供重要帮助。

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Genome-wide Transcriptome Analysis of YeastSOD1 Gene Deletion Mutant in Response to Calcofluor White Stress

ZHANG Xiaohua,LIU Xiangyong*,BIAN Weihua,XU Yanyan,XU Cong

(Department of Pharmacy,Binzhou Medical College,Yantai 264003,China)

This paper investigated the effect ofSOD1 gene deletion on the genome-wide transcriptional response to fungal cell wall-perturbing agent Calcofluor white(CFW) inSaccharomycescerevisiaeusing DNA microarray，to provide a new theoretical basis for revealing the regulatory mechanism of cell walls of plant pathogenic fungi and optimizing plant anti-fungal genetic engineering.The results showed that 211 genes (97 up-regulated genes and 114 down-regulated genes) were differentially expressed insod1Δ yeast cells compared with the wild type yeast cells after CFW treatment (10 μg/mL for 1 h).The microarray data were further confirmed by qPCR analysis,using five randomly selected,differentially expressed genes.The differentially expressed genes were mainly related to cell wall,cell metabolism,protein synthesis,cell defence,and included genes with unknown functions.Taken together,SOD1 deletion significantly affects the genome-wide transcriptional profile in response to the cell wall-perturing agent CFW in yeast.

fungal cell wall-perturbing agent; Calcofluor white;Saccharomycescerevisiae; DNA microarray; cell wall; SOD

2015-06-29

国家自然科学基金项目(31000039); 山东省自然科学基金项目(ZR2012CQ041)

张小华(1980- )，女，山东荣成人，讲师，硕士，主要从事酿酒酵母生物胁迫反应研究。 E-mail：xiaohua124@gmail.com

*通讯作者：刘向勇(1981-)，男，山东滨州人，副教授，博士，主要从事酿酒酵母分子遗传学研究。 E-mail:liuxiangyong81@gmail.com

S432.4+4

A

1004-3268(2016)01-0076-04