GPC3、GP73在肝细胞癌临床诊断中的价值

汪顺才 马洁 朱梦琪 马久明 周华 虞腊青 杨永峰 经继生



GPC3、GP73在肝细胞癌临床诊断中的价值

汪顺才 马洁 朱梦琪 马久明 周华 虞腊青 杨永峰 经继生

目的 评价磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、高尔基体蛋白73(GP73)的高表达对肝细胞癌(HCC)诊断价值。方法对39例HCC、31例肝硬化患者，基线时收集外周血及肝组织，采用ELISA法检测血清GPC3、GP73的表达量，实时定量逆转录PCR法(qRT-PCR)检测外周血单个核细胞(PBMC)及肝组织中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的相对表达量；ROC曲线分析诊断的灵敏度、特异度等指标。结果HCC组GPC3、GP73测量值显著高于肝硬化组(P<0.001)；GPC3诊断HCC的截断值> 9.3 μg/L，ROC曲线下面积(AUC)=0.956，灵敏度为89.74%，特异度为96.77%，阳性预测值为97.2%，阴性预测值为88.2%，阳性似然比(+LR)27.82，阴性似然比(-LR)0.11；GP73诊断HCC的截断值>77.68 ng/mL，AUC=0.937，灵敏度为92.31%，特异度为83.87%，阳性预测值为87.8%，阴性预测值为89.7%，+LR：5.72，-LR：0.092。结论GPC3、GP73在HCC患者中表达明显增高，且灵敏度显著优于常规AFP，GPC3、GP73的特异度与常规AFP相近，因此GPC3、GP73有望成为一种新的较好、可靠的HCC无创诊断指标。

磷酯酰肌醇蛋白聚糖3；高尔基体蛋白73；肝细胞癌

肝细胞癌(HCC)在我国发病率逐年上升，目前常规甲胎蛋白(AFP)和超声检查筛选方法敏感度、特异度均不能令人满意，很多HCC患者临床诊断时已失去有效的治疗机会。本研究发现磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、高尔基体蛋白73(GP73)在HCC诊断中具有一定应用价值。

资料和方法

一、一般资料

收集2012年12月至2013年12月句容市人民医院与南京市第二医院就诊的39例HCC、31例肝硬化患者资料。70例患者中，男性45例，女性25例；平均年龄分别为HCC组(46.2±10.1) 岁，肝硬化(乙型或丙型肝炎)组(49.2±10.3) 岁。无其他肝炎病毒重叠感染，无自身免疫性肝炎重叠。基线时收集患者外周血及肝组织，肝硬化的诊断参照《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》标准[1]，肝癌的诊断参照2011年《原发性肝癌诊断规范》标准[2]。

二、本研究设计是病例对照研究，遵循赫尔辛基宣言和我国颁布的药物临床试验质量管理规范(GCP)，方案经伦理委员会讨论通过后执行。

三、观察项目

血清GPC3、GP73表达量、外周血PBMC及肝组织中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的相对表达量、肝组织病理及AFP。肝组织来源于外科手术标本或CT引导下1 s快速穿刺标本。

四、方法

(一)主要试剂及仪器 Taq购自美国Promega公司；肝功能检测采用美国贝克曼公司自动生化仪；HBV、HCV定量PCR扩增仪为Rotor-Gene 6000(澳大利亚Corbett Research公司)，试剂盒为美国Biosourse公司提供；24孔平底培养板(美国Corning公司)； RNA提取、逆转录及qRT-PCR为逆转录试剂盒FSQ-101(日本Toyobo公司)；荧光定量试剂盒SYBR○RPremix Ex TaqTMII(日本Takara公司)；GPC3、GP73检测：上海博研生物科技有限公司生产ELISA试剂；HBVM检测：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb检测用ELISA法，按美国Abbott试剂盒说明操作；HBV DNA定量：采用Rotor-Gene 6000(澳大利亚Corbett Research公司)，扩增仪按试剂盒(美国Promega公司)说明操作。

(二)ELISA法检测血清GPC3、GP73表达量操作步骤

准备试剂，96孔板中加入准备好的样品和标准品，37℃ 30 min，洗板5次，加入酶标试剂，37℃ 30 min，洗板5次，依次加入显色液A、B，37℃显色10 min后加入终止液，15 min之内读取OD值。以标准品的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD 值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数(5倍)；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数(5倍)，即为样品的实际浓度。

(三)qRT-PCR法检测外科手术切除或者肝穿刺肝组织中GPC3 mRNA及GP73 mRNA表达操作步骤

①肝组织细胞用10%胎牛血清的DMEM培养液培养(美国Invitrogen)，加青霉素、链霉素使之终浓度分别为100 U/mL，置于37℃，5% CO2的细胞培养箱内。用Trizol试剂(美国Invitrogen)收集细胞后，利用常规酚/氯仿抽提法提取细胞内总RNA和DNA；组织内总RNA和基因组DNA的提取也按照Trizol试剂的说明操作。浓度用NanoDrop1000 (美国Nanodrop)检测。随后根据高容量cDNA逆转录试剂盒(美国Applied Biosystems)说明将提取的RNA逆转录成cDNA。② GP73与β-actin及GPC3与β-actin两种RT-PCR反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL、上游引物(10 μmol/L)1.6 μL、下游引物(10 μmol/L) 1.6 μL、 模板2 μL、ddH2O 4.8 μL。反应条件 ：95 ℃ 3 min；95 ℃ 40 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 7 min，40 个循环，退火时采集荧光。GP73 上游引物 ：5′ -CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3′ ，下游引物 ：5′-ATGATCCGTGTCTGGAGGTC-3′；GPC3上游引物：5′ -TGGACATCAATGAGTGCCTCC -3′，下游引物：5′-CCACATTCTGGTGAGCATTCG-3′；β-actin 上游引物 ：5′-CGTACACTGGCATCGTGAT-3′ ，下游引物 ：5′-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′。GP73及GPC3 mRNA表达水平通过ABI 7500 Real-time PCR System(美国Applied Biosystems)进行检测。

(四)qRT-PCR法检测外周血PBMC内GPC3 mRNA及GP73 mRNA表达操作步骤

①外周血PBMC分离：取2 mL全血置于 EDTA 抗凝剂试管中，加入等体积PBS溶液混匀。另准备1个干净的10 mL离心管，加入4 mL人淋巴细胞分离液，在人淋巴细胞分离液面上1 cm处沿管壁缓慢加入血液与PBS混合液。切记勿破坏液体界面。1500 rpm离心 20 min后，小心吸取云雾状白膜层，即为PBMC。②将PBMC抽提总RNA后，逆转录合成cDNA，最后进行目的基因PCR扩增。GPC3、GP73及β-actin 荧光定量PCR引物由本研究室设计，上海生物工程有限公司合成。GPC3：For：GCCCATTCT-CAACAACGC，Rev：CACTTTCAAACCCTTCCTCAT;GP73: For：CAGCGCTGATTTTGAGATGA，Rev：ATGATCCGTGTCTGGAGGTC;β-actin：For：CG-TACCACTGGCATCGTGAT，Rev：GTGTTGGC-GTACAGGTCTTTG。GP73及GPC3 mRNA表达水平通过ABI 7500 Real-time PCR System(美国Applied Biosystems)进行检测。

(五) AFP测定

采用Centaur XP化学发光法分析仪及其配套试剂(德国SIEMENS公司)检测患者血清AFP浓度，按照仪器和试剂说明书进行操作。

(六)MR或CT

五、统计学处理

结 果

一、入选病例基线情况

由表1可见，70例入选本研究的HCC与肝硬化患者在性别、年龄上差异无统计学意义(均P>0.05)，两组病例的临床特征具有可比性。

表1 入选病例基线情况

二、两组病例GPC3、GP73的测量值比较

HCC组：GPC3(15.8±3.86) μg/L、GP73(107.46±29.5) ng/L，肝硬化组：GPC3(7.51±1.38) μg/mL、GP73(65.09±17.23) ng/mL。由此可见，HCC组GPC3、GP73的测量值显著高于肝硬化组测量值(P<0.001)。GPC3、GP73测量值增高患者中GPC3>9.3 μg/L、GP73>77.68 ng/mL患者发生HCC的风险更高达92.31%。

三、GPC3与GP73诊断HCC的ROC曲线分析

由图1、图2可见，GPC3判断的截断值>9.3 μg/L，AUC=0.956，灵敏度为89.74%，特异度为96.77%，阳性预测值为97.2%，阴性预测值为88.2%，+LR为27.82、-LR为0.11；GP73判断的截断值>77.68 ng/mL，AUC=0.937，灵敏度为92.31%，特异度为83.87%，阳性预测值为87.8%，阴性预测值为89.7%，+LR为5.72、-LR为0.092。

（一）科学规划产业开发和布局，选址中欧班列（重庆）起点-沙坪坝区土主、回龙坝等乡镇区域，打造“一带一路”现代农业国际合作示范区。从水陆空三大国际枢纽片区来看，江北空港、果园港片区均在两江新区范围内，以发展先进制造业和国际物流的产业载体带动毗邻村镇融入国际化，唯有中欧班列（重庆）起点片区缺乏相应能级规格的国际合作示范园区。根据错位发展原则，建议在中欧班列（重庆）起点附近的土主、回龙坝等村镇区域选址，集中连片规划发展“‘一带一路’现代农业国际合作示范区”。

图1 GPC3筛检HCC的ROC曲线

图2 GP73筛检HCC的 ROC曲线

四、两条ROC曲线比较

由图3可见，GPC3与GP73的AUC差异无统计学意义(P>0.05)；说明两个指标在早期HCC的预测方面一致。

图3 GPC3与GP73筛检HCC的ROC曲线比较

五、qRT-PCR 法检测PBMC中GPC3、GP73 mRNA表达水平

两组病例PBMC中GPC3、GP73 mRNA的表达量分别为HCC组：GPC3 (16.94±8.67) μg/L、GP73(12.51±2.97) ng/mL，肝硬化组：GPC3 (15.63±7.35) μg/L、GP73( 14.25±3.67) ng/mL。HCC组GPC3、GP73 mRNA的表达量与肝硬化组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见图4)；推测可能是GPC3、GP73主要是肝癌细胞分泌后释放入血，所以PBMC中表达差异无统计学意义；具体原因有待进一步研究。

六、ELISA法检测血清中GPC3、GP73含量的相关性分析

将肝硬化组血清中GPC3、GP73含量做相关性分析，结果显示，两个指标的相关系数r=0.6694，具有显著的正相关关系(P<0.0001)；HCC组血清中两个指标的相关系数r=0.4645，也具有显著的正相关关系(P=0.0029)(见图5)。

七、GPC3、GP73的灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值与MR/CT比较

GPC3的灵敏度为89.74%，特异度为96.77%，阳性预测值为97.2%，阴性预测值为88.2%；GP73的灵敏度为92.31%，特异度为83.87%，阳性预测值为87.8%，阴性预测值为89.7%；MR/CT的灵敏度为70%，特异度为98%，阳性预测值为92.3%，阴性预测值为96.3%。由此可见，GPC3、GP73的灵敏度明显较MR/CT高(P<0.05)，特异度差异无统计学意义(P>0.05)。

八、两组病例外周血GPC3、GP73浓度值及组织mRNA表达相对值

HCC组：GPC3(16.81±0.56) μg/L、GP73(115.92±7.01) ng/mL；GPC3 mRNA(8.91±3.70) μg/L，GP73 mRNA (68.41±32.86) ng/mL。肝硬化组：GPC3(7.41±0.25) μg/L、GP73(64.63±3.07) ng/mL；GPC3 mRNA (3.04±0.58) μg/L、GP73 mRNA (2.32±0.25) ng/mL。外周血中HCC组GPC3、GP73的测量值显著高于肝硬化组测量值(P<0.001)；组织中HCC组GPC3 mRNA、GP73 mRNA表达高于肝硬化组(见表2)。

九、GPC3、GP73与AFP的灵敏度及特异度比较

GPC3灵敏度20/23=86.96%(95%CI75.8～97.7)，特异度28/29=96.55%(95%CI83.3～99.9), 阳性预测值20/21=95.24%(95%CI85.2～99.9)；GP73灵敏度21/23=91.31%(95%CI79.1～

图4 qRT-PCR 法检测PBMC中GPC3、GP73 mRNA的含量

图5 ELISA法检测血清中GPC3、GP73含量的相关性

表2 HCC组及肝硬化组外周血GPC3、GP73浓度及组织中mRNA表达值

98.4)，特异度25/29=86.21%(95%CI66.3～94.5)，阳性预测值21/25=84.01%(95%CI73.8～95.9)。另外通过查阅文献，将AFP的截断值定为20 ng/mL[3]，52例患者血AFP值从住院期间化验结果中获得(表2)：灵敏度为14/23=60.87%(95%CI40～65),特异度24/29=82.76% (95%CI76～91)，阳性预测值14/19=73.68 %(95%CI9～32)。

十、GPC3、GP73 表达及其病理学特征

HCC组患者中外周血GPC3、GP73浓度及组织mRNA表达水平与年龄、性别、肿瘤大小及肝癌临床分期间差异无统计学意义(均P>0.05)；而HCC组患者GPC3表达与病理分级间差异有统计学意义(P<0.05)(表3)，病理分级为3级的HCC组患者GPC3低于1～2级患者。

表3 HCC患者血清GPC3、GP73及肝组织相应mRNA表达水平的临床病理学特征分析

讨 论

目前HCC发病率极高，而且在全世界范围内逐渐上升。HCC患者5年生存率不到10%，是恶性程度最高的肿瘤之一。慢性肝炎病毒感染导致肝纤维化和肝硬化是HCC最主要的危险因素。很多HCC患者临床诊断时已失去有效的治疗机会；如果能够在早期诊断，包括外科手术切除肿瘤、肝移植、经导管动脉化疗栓塞术(TACE)、射频消融术(RFA)等综合性治疗方法能取得相对较好的效果[4]。2005年，美国肝病学会(AASLD)提出对于HCC高危患者的监测方案，每6个月进行血清AFP和超声检查[5]。近年全世界广泛应用MR/CT，有望比超声检查提高灵敏度及特异度。由于检查的代价及设备的要求使广大基层难以开展。因此，各国学者从未停止寻找新的更好的HCC肿瘤标志物。理想的肿瘤标志物需要较高的特异度，能够将HCC与肝硬化、肝炎、肝再生结节区分开来；同时还需较高的敏感度，能够在HCC早期诊断，且有易检测、可重复、侵入少的特点。新的基因和蛋白组学技术发展对筛选新的肿瘤标志物提供了很大的帮助。然而，肿瘤标志物从实验室到临床应用，还有一个很长的过程。美国癌症研究所认为一个肿瘤标志物临床应用前必须经历以下5个阶段：即临床前研究、临床验证、纵向回顾研究、预期检测、肿瘤控制研究[6]。本课题组研究的两种HCC的血清标志物在国内外研究概况及水平：(1)GPC3是一种于1995年发现的细胞外糖蛋白，属于硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)家族的一员，是一种肿瘤抑制物质，可以调节细胞增殖[7]。功能：正常人组织中表达极少，在正常肝组织中不表达，可能在肝脏功能中发挥着重要作用[8]。结构：GPC3基因定位在X染色体上，编码产物为一具有580个氨基酸，大小为66 kD左右的HSPG。通常GPC3通过C端的糖磷脂酞肌醇连接在细胞膜表面，A358和A359之间的位点被切开可获得分泌型的可溶性蛋白形式。检测资料：用RT-PCR检测mRNA水平上的表达或者用Western blot从蛋白水平上检测[9]，ELISA法也可以检测[10]。(2)GP73是 2000 年，由 Kladney等[11]发现的一个高尔基体二型跨膜蛋白，GOLPH2 蛋白定位于细胞高尔基体，且主要位于高尔基体膜顺面(Trans)；但同时研究也发现，GOLPH2 可以通过内膜系统转运到细胞外，并剪切分泌到细胞外基质；而且有可能存在内化，从细胞表面再次回到细胞高尔基体的过程[12-13]。结构：体外转译研究表明，其是一个完整的膜蛋白分子，该基因在体内正常翻译的蛋白在 SDS-PAGE 电泳上表现的分子量为 73 kD；免疫定位研究表明，该蛋白定位在高尔基体上，所以 GOLPH2 最初定名为 GP73。功能：GOLPH2 最先是从新城疫病毒感染研究发现，始终与疾病存在紧密联系，尤其与肝病关联。Kladney等[10]研究发现，GOLPH2 与肝脏腺病毒感染相关，肝细胞感染腺病毒后，细胞内 GOLPH2 表达水平显著升高，同时腺病毒缺失 E1A 的 CTBP 结构域后，上调效果消失；GP73表达与肝纤维化的轻重程度成正相关(肝纤维化程度越重，GP73越高)，患者从肝硬化发展成HCC时GP73表达达到高峰，GP73在HCC患者表达与AFP无明显的相关性(能够筛选出AFP假阴性的肝癌)。所以GP73高表达可能与HCC发生、发展有关[14]。检测资料：用RT-PCR检测mRNA水平上表达或者用Western blot从蛋白水平上检测，ELISA法也可以检测。本研究采用ELISA法对患者血清中GPC3和GP73 的蛋白水平进行检测，同时利用qRT-PCR法对相同患者PBMC中GPC3 mRNA和GP73 mRNA水平进行检测。ELISA法结果显示，HCC组血清中GPC3和GP73的含量显著高于肝硬化组；GPC3、GP73判断的灵敏度，特异度，阳性预测值，阴性预测值,约登指数,AUC，似然比(+LR，-LR)均很高；且无论在HCC组还是在肝硬化组，GPC3和GP73两个指标之间均具有显著的正相关关系，并且GPC3与GP73的AUC差异无统计学意义(P>0.05)，说明两个指标在早期HCC的预测方面一致；提示可以根据GPC3和GP73的水平作为诊断HCC的临床指标。qRT-PCR法结果显示，根据PBMC中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的表达水平，无法区分HCC组和肝硬化组；比国际公认的AFP灵敏度显著更高，特异度与常规的AFP相近；也比国际公认的MR/CT灵敏度显著更高，特异度与常规的MR/CT相近。qRT-PCR法所需的检测标本PBMC较难获得，整个操作过程技术条件要求高，费用昂贵，MR/CT对基层医疗单位而言设备难以达到，因此均不适宜基层医疗单位开展。相比较而言，ELISA方法简单，所需检测标本血清比较容易获得，患者所付费用明显降低，同时对基层医疗单位设备的要求可操作性也低。因此GPC3 、GP73有望成为一种新的较好、可靠的HCC无创诊断指标。

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(本文编辑：易玲)

江苏省卫生厅自然科学基金项目(YG201311)；江苏大学临床科技发展基金项目(JLY20120103)

212400 江苏 句容市人民医院感染科(汪顺才，马久明，周华，虞腊青，经继生)；江苏大学医学院(马洁)； 复旦大学附属华山医院(朱梦琪)；南京市第二医院(杨永峰)

经继生，Email：jrjjs2008@sina.com

2016-07-02)