死亡相关蛋白激酶1在膀胱癌中的表达及发病机制

谢剑云 陈伟东 杨晓莉

(福建省中医药大学附属人民医院泌尿外科，福建 福州 350004)

死亡相关蛋白激酶1在膀胱癌中的表达及发病机制

谢剑云 陈伟东 杨晓莉1

(福建省中医药大学附属人民医院泌尿外科，福建 福州 350004)

目的探讨死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)在膀胱癌中的表达及发病机制。方法 选取86例膀胱癌患者，提取膀胱癌组织和癌旁正常组织总RNA以及蛋白，采用RT-PCR法以及Western印迹法测定2组患者DAPK1 mRNA 以及蛋白在膀胱癌及癌旁组织中的表达。结果 86例膀胱癌组织标本中DAPK1阳性表达率为27.91%(24/86)，显著低于癌旁组织的67.44%(58/86)(χ2=26.94，P<0.05)。膀胱癌组织标本中DAPK1 mRNA阳性表达相对灰度值明显低于癌旁组织标本(t=21.33，P<0.05)，膀胱癌组织标本中DAPK1蛋白表达显著低于癌旁组织标本(t=17.99，P<0.05)。TNM分期为Ⅰ～Ⅱ级者DAPK1 mRNA表达率显著高于Ⅲ级(P<0.01)，无淋巴结转移者DAPK1 mRNA表达率显著高于有淋巴结转移(P<0.01)。癌组织DAPK1 mRNA表达与患者的年龄、性别以及肿瘤部位、大小无关(P>0.05)。结论 DAPK1在膀胱癌组织标本中较癌旁组织表达低，推测其与抑制膀胱癌表达以及转移相关。

DAPK1；膀胱癌；发病机制

膀胱癌(CUB)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，病理类型包括膀胱尿路上皮癌、鳞状细胞癌以及腺癌等〔1〕。早期患者较难察觉，当出现尿路刺激征、血尿、水肿等明显症状前来就诊，已是晚期，临床治疗复杂、预后差〔2〕。死亡相关蛋白激酶(DAPK)1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与γ-干扰素(IFN-γ)诱导的细胞凋亡，并起关键作用〔3〕。有研究发现，DAPK1于包括肺癌、胃癌、CUB等在内的多种恶性肿瘤中表达较正常组织低〔4〕。但国内关于DAPK1 在泌尿系统恶性肿瘤尤其是CUB中的研究鲜有报道。本文通过检测CUB患者肿瘤组织DAPK1的表达，探讨DAPK1在CUB中的发病机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2013年8月至2015年7月我院泌尿外科收治的86例CUB患者，男66例，女20例，年龄28～77〔平均(54.24±7.72)〕岁。其中移行上皮癌27例、鳞状上皮癌21例、腺上皮癌18例、未分化癌20例。本研究已获得本医院的伦理学相关机构批准授权。

1.2 纳入标准 均符合《膀胱癌诊断治疗指南》中CUB的诊断标准，血常规检测白细胞计数 ≥4.0×109/L，血小板计数≥8.0×109/L，血红蛋白≥90 g/L；卡氏功能状态量表(KPS)评分>70分，预计生存期超过3个月，均有完整的影像学资料；膀胱镜及临床病理学检查均显示为CUB；年龄≥18岁；患者以及家属对本研究具体情况了解知情并自愿参与，签署知情同意书。

1.3 排除标准 ①精神、神志异常不能配合者；②患有严重心、肝、肾、肺、脑疾病者；③合并肝癌、肾癌、脑癌等其他恶性肿瘤者；④患有艾滋病、梅毒、病毒性肝炎、结核等传染病者；⑤患有再障、白血病等血液性疾病者；⑥近3个月接受过化疗、放疗、介入治疗等。

1.4 肿瘤组织DAPK1表达检测 参考《新编常见恶性肿瘤诊治规范》〔5〕。CUB手术后，取肿瘤标本离体后洗净，确定其大小以及切缘，分别切取癌组织以及肿瘤边缘超过3 cm的正常膀胱壁组织，分装入无菌管，进行标记，迅速置于-80℃低温冰箱备用，采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR检测DAPK1 mRNA表达)。提取总RNA，在冰上取每例样本组织50 mg入匀浆器，研磨，恢复正常温度后，采用4 000 r/min，4℃离心5 min分离杂质，离心后取上层清液，加入500 μl预冷的异丙醇震荡恢复室温，12 000 r/min，4℃离心10 min以沉淀DNA，离心后取上层清液，加入1 ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀，震荡，取离心管底部至白色沉淀物于75%乙醇上漂浮，7 500 r/min，4℃离心5 min吸出乙醇，加入适量的无RNase水以溶解RNA，置于-80℃低温冰箱备用。采用分光光度计法对RNA浓度、纯度进行测定。用免疫组化SP法检测DAPK1蛋白表达。称取40 mg标本组织，入匀浆器，研磨，恢复正常温度后，12 000 r/min，4℃离心10 min备用，将配置好的0.5 mg/ml的蛋白标准液分别按0，1，2，4，8，12，16，20 μl置入标准孔96孔板中，每份磷酸盐缓冲液(PBS)补足至20 μl，标准孔和样品孔200 μl二喹啉甲酸(BCA)液，37℃离心30 min，采用酶标仪对各孔波长562 nm处吸光度进行记录，参照已绘制的标准曲线计算样品蛋白的浓度。采用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳得出mRNA表达差异的电泳图。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件。计数资料用χ2检验，组间等级资料比较采用方差分析，计量资料比较采用t检验。

2 结 果

2.1 DAPK1 mRNA表达情况 86例CUB组织标本中DAPK1 mRNA阳性表达率为27.91%(24/86)，明显低于癌旁组织标本中的67.44%(58/86)(χ2=26.94，P<0.05)。

2.2 DAPK1 mRNA的相对灰度值以及DAPK1蛋白表达情况 24例CUB组织标本中DAPK1 mRNA阳性表达相对灰度值(0.26±0.03)明显低于58例癌旁组织标本中DAPK1 mRNA阳性表达相对灰度值(0.58±0.06)(t=21.33，P<0.05)，CUB组织标本中DAPK1蛋白表达相对光密度值(0.36±0.04)显著低于癌旁组织标本(0.65±0.06)(t=17.99，P<0.05)。图1、图2。

N：癌旁组织；C：癌组织；下图同图1 DAPK1 mRNA表达电泳图

图2 DAPK1蛋白Western印迹电泳图

2.3 DAPK1 mRNA表达与CUB临床病理参数的关系 TNM分期为Ⅰ～Ⅱ级者DAPK1 mRNA表达率〔38.10%(24/63)〕显著高于Ⅲ级(0%)(P<0.01)，无淋巴结转移者DAPK1 mRNA表达率〔38.71%(24/62)〕显著高于有淋巴结转移者(0)(P<0.01)，癌组织DAPK1 mRNA表达与患者的年龄、性别以及肿瘤部位、大小无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 DAPK1 mRNA表达与CUB临床病理参数的关系〔%(n/N)〕

临床病理参数nDAPK1mRNA表达χ2值P值年龄 <50岁4131 71(13/41) ≥50岁4524 44(11/45)0 56>0 05性别 男6627 27(18/66) 女2030 00(6/20)0 60>0 05肿瘤大小 <2cm5435 19(19/54) ≥2cm3215 63(5/32)4 41>0 05

3 讨 论

CUB高发年龄为50～70岁，随着年龄增高发病率增高，男性CUB发病率远高于女性，约为其的3～4倍〔6〕。CUB的早期筛查在技术上和可行性具有很大的难度，其发病率以及死亡率仍居高不下。CUB早期患者体内即出现生化指标以及代谢紊乱，体液、排泄物质以及组织等出现质与量的改变；此外，肿瘤相关抗原、癌基因以及同工酶等均广泛存在于宿主细胞内〔7〕。其中，发挥最关键性作用的是遗传突变中癌基因的激活和抑癌基因的失活。

最新研究表明，抑癌基因在癌症发生发展中的作用不低于原癌基因〔8〕。抑癌基因在癌症组织中呈低下或者缺失的状态，如结直肠癌组织中，结肠癌缺失基因(DCC)以及p53等抑癌基因丢失，因此，抑癌基因在一定程度上能够反映癌症的表达以及发展。DAPK1即为抑癌基因的一种〔9〕，是一种细胞凋亡正性调节因子，能够通过激活细胞因子以及原癌基因诱导的过度增生等死亡信号诱导的细胞凋亡抑制细胞癌变。曾有研究显示，小鼠CUB模型中，DAPK1能够抑制肿瘤的发生以及转移〔10〕。有研究发现，来源于CUB以及肾细胞癌细胞系中的20%～30%患者存在DAPK1 mRNA低下甚至缺失〔11〕。证实DAPK1 mRNA与蛋白的表达能够抑制CBU的发生。

临床针对DAPK1的研究多针对DAPK1甲基化与肿瘤的关系，于肺癌、胃癌、宫颈癌以及CUB等恶性肿瘤和恶性肿瘤的细胞系中出现启动子CpG区出现高甲基化〔4〕。本研究证实淋巴结转移以及晚期CUB患者的癌组织中DAPK1的表达较低，提示DAPK1的表达具有抑制癌组织转移以及发展的作用。有研究显示，DNA异常甲基化存在可逆性，应用甲基化转移酶抑制剂可以逆转甲基化异常，使出现甲基化的失活抑癌基因恢复其正常功能〔12〕。因此，针对包括DAPK1在内与CUB发生发展具有相关性的抑癌基因异常甲基化和表达水平联合检测，可以提高CUB早期筛查的准确性以及灵敏性，同时助于CUB病因、基因靶向治疗以及预后的探究。

1 高 放，张凤梅，李胜水，等.膀胱良、恶性上皮肿瘤中MMP-9的表达及临床意义〔J〕.现代肿瘤医学，2014；22(1)：134-6.

2 周 涓，袁学明，梁如生，等.凝血酶联合冰冻盐水膀胱灌注治疗膀胱癌TURBT术后难治性血尿临床观察〔J〕.国际医药卫生导报，2015；21(12)：1708-10.

3 张 满，王建民.死亡相关蛋白激酶与肿瘤的诊断及治疗〔J〕.医学综述，2008；14(8)：1176-8.

4 杨永姣，刘 莉，陈业刚，等.膀胱癌组织中肺癌肿瘤抑制物1基因启动子甲基化状态和蛋白表达及其临床意义〔J〕.中国现代医学杂志，2015；25(23)：35-9.

5 中国抗癌协会.新编常见恶性肿瘤诊治规范〔M〕.北京：中国协和医科大学出版社，1999：15-71.

6 温登瑰，单保恩，张思维，等.2003～2007年中国肿瘤登记地区膀胱癌的发病与死亡分析〔J〕.肿瘤，2012；32(4)：256-62.

7 王 冰，邱 红.肿瘤标志物在肺癌诊断中的研究进展〔J〕.国际检验医学杂志，2013；34(24)：3384-6.

8 何亚洲，温桂兰.原癌基因Pim-1在非小细胞肺癌中的表达及与细胞凋亡的关系〔J〕.广东医学，2014；35(19)：3085-8.

9 夏海发，尚 游，姚尚龙.死亡相关蛋白激酶1的分子结构与炎症调节作用的研究进展〔J〕.中华危重病急救医学，2015；27(2)：158-60.

10 何凌峰，管考鹏，许克新，等.热休克蛋白70在小鼠膀胱癌模型中的表达及其与微血管密度的关系〔J〕.中国药物与临床，2015；15(11)：1566-7.

11 钟 华，顾方六，俞莉章，等.白细胞介素6在肾癌和膀胱癌细胞系中的表达〔J〕.中华泌尿外科杂志，1996；17(1)：17-9.

12 李培坤，耿小平，朱立新.DNA甲基化抑制剂研究进展〔J〕.国际药学研究杂志，2010；37(3)：198-202.

〔2015-10-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

福建省自然科学基金(No.2016J0105)

谢剑云(1980-)，男，硕士，主治医师，主要从事肿瘤研究。

R73

A

1005-9202(2016)24-6161-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.055

1 福建省中医药大学附属人民医院肿瘤外科