青海地区急性呼吸道感染症候群中人冠状病毒及鼻病毒分子流行病学研究

刘高山 李红 牛培华 石燕 姜双应 徐莉立 陆柔剑 赵生仓 谭文杰

102206北京，中国疾病预防与控制中心病毒病预防控制所，卫生和计划生育委员会医学病毒学与病毒病重点实验室（刘高山、牛培华、陆柔剑、谭文杰）；810007西宁，青海省疾病预防控制中心（李红、石燕、姜双应、徐莉立、赵生仓）

青海地区急性呼吸道感染症候群中人冠状病毒及鼻病毒分子流行病学研究

刘高山 李红 牛培华 石燕 姜双应 徐莉立 陆柔剑 赵生仓 谭文杰

102206北京，中国疾病预防与控制中心病毒病预防控制所，卫生和计划生育委员会医学病毒学与病毒病重点实验室（刘高山、牛培华、陆柔剑、谭文杰）；810007西宁，青海省疾病预防控制中心（李红、石燕、姜双应、徐莉立、赵生仓）

刘高山、李红共同第一作者

目的了解青海地区急性呼吸道感染人群中人冠状病毒（human coronavirus，HCoV）及鼻病毒（human rhinovirus，HRV）的分布，探讨其分子流行病学特征。方法采集2010年5月至2015年5月青海地区急性呼吸道症候群病例鼻咽拭子445例，采用荧光定量反转录聚合酶链式反应（quantitative real⁃time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT⁃PCR）方法对HCoV六种亚型（OC43，HKU1，229E，NL63，SARS和MERS）及HRV进行检测，并分析其分子流行病学特点。结果445例样本中共检出HCoV 34例，检出率7.64%，其中HCoV⁃OC43 19例（4.26%），HCoV⁃HKU1 15例（3.37%），其它亚型未检出。HRV检出16例，检出率3.59%。HCoV⁃OC43在20⁃60岁年龄组检出率最高，为9.48%，且不同年龄组差异有统计学意义（Fisher’s确切概率P＝0.0011）。HRV在门急诊病例中的检出率比住院病例高，为6.72%，且差异有统计学意义（Fisher’s确切概率P＝0.0432）。HCoV⁃OC43夏季检出率最高，为7.20%（9／125），HCoV⁃HKU1夏季检出率最高，为9.60%（12／125），不同季节HCoV检出率差异有统计学意义（χ2＝25.08，P＜0.0001）。HRV春季检出率最高，为10.17%（6／59），不同季节检出率差异有统计学意义（Fisher’s确切概率P＝0.0449）。HCoV感染阳性样本Ct值中位数36.81（35.54⁃37.49），在住院病例中为36.93（35.54⁃37.53），在门急诊病例中为36.68（31.18⁃36.84），差异无统计学意义。HRV阳性样本Ct值中位数31.83（27.16⁃33.65），在住院病例中为28.97（26.39⁃33.79），在门急诊病例中为32.34（30.85⁃33.65），差异无统计学意义。结论HCoV及HRV流行高峰主要为夏季和春季，其中HCoV⁃OC43／HCoV⁃HKU1是HCoV感染的主要亚型。Ct值在一定程度上反映了HCoV和HRV在不同病例类型中病毒载量的差异。

Fund programs：China Mega⁃project for Infectious Disease Grants from the Ministry of Science and Technology and the Ministry of Health（2013ZX10004601，2014ZX10004001，2012ZX10004⁃208）；National Key Research and Development Plan（2016YFD0500301）

人冠状病毒（human coronavirus，HCoV）是一种有包膜、正链RNA病毒，基因组全长约28⁃32Kb［1］。目前，HCoV有6种，其中HCoV⁃OC43，HCoV⁃229E，HCoV⁃HKU1，HCoV⁃NL63主要引起常见的急性呼吸道症状［1⁃3］。而分别在2003年出现的SARS⁃CoV以及2012年出现的MERS⁃CoV则可以引起严重呼吸道感染并发多器官衰竭，致死率高，引起人们高度关注［4，5］。人鼻病毒（human rhinovirus，HRV）是一种常见的呼吸道感染病毒之一，超半数以上急性呼吸道感染都与之有关，同时亦可引起下呼吸道感染如肺炎［6，7］。尽管国内外关于HCoV与HRV分子流行病学的研究很多，但我国西北地区（尤其是青海省）的相关研究甚少。为了解青海地区急性呼吸道症候群人群中HCoV及HRV的流行情况，本研究对该地区的急性呼吸道症候群病例鼻咽拭子中的HCoV及HRV进行检测，并分析其流行病学特征。

1 材料与方法

1.1 病例定义与样品类型2012年5月至2015年5月以青海省红十字医院及青海省妇产儿童医院作为急性呼吸道症候群监测哨点收集病例，病例纳入标准：急性起病，具有发热、寒战、白细胞升高、降低或分布异常等急性感染表现之一，且具有不同程度呼吸道临床表现（包括咽痛、咽部不适、鼻塞、流涕，鼻／咽／喉明显充血、水肿、咳嗽，咳痰、气短，听诊呼吸音异常，胸痛等症状之一）。于病人就诊12 h内采集病例鼻咽拭子，放⁃70℃留存检测。病例资料收集采用统一设计的发热症候群监测调查问卷，由经过培训的临床医师完成。内容主要包括人口统计学信息，临床症状、体征、血常规、临床生化检查、影像学检查、主要治疗和预后等信息。样本的采集过程及临床资料的获取均具备知情同意。

1.2 核酸提取及病毒检测使用QIAsymphony SP核酸提取纯化分析仪（Qiagen，德国）提取核酸，严格按照说明书进行操作，最后溶到60 μl的洗脱缓冲液中。采用荧光定量反转录聚合酶链式反应（quantitative real⁃time reverse transcription⁃polymerase chain reaction，qRT⁃PCR）方法对样本进行检测。试剂盒为One Step PrimeScriptTMRT⁃PCR Kit（TaKaRa，日本），检测HCoV及HRV的引物、探针及反应条件参考文献［8⁃9］。

1.3 统计学方法使用SAS 9.3软件进行统计学分析。计数资料用率或构成比（%）表示。偏态分布计量资料用中位数和四分位数表示。卡方检验或者Fisher确切概率法进行计数资料组间的比较。Wilcoxon秩和检验（统计量Z）进行计量资料组间的比较。P＜0.05差异考虑有统计学意义。

2 结果

2.1 一般信息本次共采集发热呼吸道患者鼻咽拭子445例，男性265例，女性180例。男女比1.42：1。中位年龄16岁，年龄最小出生1 d，最大87岁。住院病例326例，占73.26%。临床表现发热（429例，98.72%），咳嗽（296例，66.52%）为主，但也可见胃肠道反应，如腹泻15例，占3.37%（表1）。

2.2 病毒检测445例鼻咽拭子样本中，检出HCoV 34例，检出率7.64%，其中HCoV⁃OC43 19例（4.26%），HCoV⁃HKU1 15例（3.37%），其余亚型未检出。HRV检出16例，检出率3.59%。HCoV与HRV未见混合感染。HCoV⁃OC43在20⁃60岁年龄组检出率最高，为9.48%，且不同年龄组差异有统计学意义（Fisher’s确切概率P＝0.0011），不同性别和病例类型中检出率差异无统计学意义。HCoV⁃HKU1在不同年龄，不同性别，不同病例类型中检出率差异无统计学意义。HRV在门急诊病例中的检出率比住院病例高，为6.72%，且差异有统计学意义（Fisher’s确切概率P＝0.0432），而不同年龄，性别中检出率差异无统计学意义（表1）。

表1 冠状病毒和鼻病毒感染病例在不同组间分布比较Tab.1 A comparison analysis of patients with HCoV infection and HRV infection in different groups

2.3 季节分布HCoV及HRV感染分布存在季节趋势。HCoV⁃OC43夏季检出率最高，为7.20%（9／125）。HCoV⁃HKU1夏季检出率最高，为9.60%（12／125）。不同季节HCoV检出率差异有统计学意义（χ2＝25.08，P＜0.0001）；HRV四季均可检出，春季最高，检出率10.17%（6／59），不同季节检出率差异有统计学意义（Fisher’s确切概率P＝0.0449）（图1）。

2.4 Ct值分布总体上，HCoV Ct值中位数36.81（35.54⁃37.49），HRV Ct值中位数31.83（27.16⁃33.65）。HCoV感染住院病例Ct中位数36.93（35.54⁃37.53），门诊病例Ct值中位数36.68（31.18⁃36.84），二者差异无统计学意义；HRV感染住院病例Ct值中位数28.97（26.39⁃33.79），门急诊病例Ct值中位数32.34（30.85⁃33.65），二者相比差异无统计学意义（图2）。

3 讨论

HCoV和HRV是呼吸道感染的常见病毒，二者在普通感冒病例检出比例分别为10%⁃15%和30%⁃50%［6］，同时也可以引起严重呼吸道感染症状。本研究利用qRT⁃PCR的方法对青海地区急性呼吸道症候群病例进行检测，首次探讨了该地区急性呼吸道感染人群中HCoV和HRV的分布情况。

图1 冠状病毒和鼻病毒阳性检出季节分布Fig.1 Season distribution of patients with HCoV infection and HRV infection

阴影部分表示Ct值的概率密度估计，阴影部分的宽度表示样本Ct观察值落在相应处的比例。同时，中位数，四分位数也在图中展示图2 不同组Ct值分布的小提琴图Shaded area represents the density estimation of Ct values，while the width of the shading represents the proportion of observations at that value.The median，inter⁃quartile range are also shownFig.2 Violin plots of Ct values by different group

本研究共采集鼻咽拭子样本445例，其中检测到HCoV 34例，检出率7.64%，与北京，香港，泰国，意大利等地研究报道［10⁃13］的HCov在不同人群中的阳性检出率（2.6%⁃16.82%）相一致，但明显高于天津（1.64%）［14］、广东（2.43%）［15］、成都（0.99%）［16］等省地发热呼吸道病人中HCoV的检出率，这种差异可能与入组病例构成、病例采集时间、地点及检测方法不同有关。本研究显示HCoV流行高峰在夏秋季，广州［17］研究报道HCoV⁃OC43流行高峰在夏季，HCoV⁃HKU1主要在冬季，而北京［10］研究报道HCoV⁃OC43主要流行在春季，HCoV⁃HKU1没有明显季节流行特点。青海、北京和广州分别位于高原、平原和沿海地区，考虑到三研究均采用qPCR的方法进行HCoV检测，提示高原地区HCoV⁃OC43季节分布与沿海相似但与平原地区不同上，而HCoV⁃HKU1与平原及沿海地带都不同。同时考虑到本研究样本量较少，因此更多的研究病例是找到季节流行特点的重要因素。本研究中HCoV⁃OC43在20⁃］60岁年龄组检出率较高，与之前北京地区研究［10，18］（各年龄组检出率差异无统计学意义）有差异，但要注意到HCoV⁃HKU1在60岁以上年龄组中检出率较高，与其研究一致，提示HKU1在60岁以上人群更容易感染。

多项研究表明HRV在急性呼吸道感染儿童中检出率约14.2%⁃23%［19⁃20］，但潘明等［16］报道发热呼吸道症候群患者中HRV检出率4.97%。本研究HRV检出率与之相比略有差异，提示HRV分布存在着地区间的差异。虽然HRV不同年龄、不同性别检出率差异无统计学意义，但在住院病例中的检出率（6.72%）与门急诊病例检出率（2.45%）的差异有统计学意义，提示HRV在住院患者中有更高的检出率，但HRV与住院患者疾病严重程度之间的关系需要更多的研究去证实［19］。HRV在四季均可检出，与Onyango等［19］研究结果相一致。但应注意，在青海地区春季HRV有检出率更高。

qRT⁃PCR的Ct值在一定程度上反映了检测样本中起始病毒载量，Fuller JA等［21］报道临床表现严重的群体有着更低的Ct值，即病毒载量更高。本研究中对病例就诊12 h内采集的鼻咽拭子标本检测，HCoV与HRV的Ct值中位数分别为36.81、31.83，提示急性呼吸道感染病例就诊时HCoV与HRV病毒载量分布不同，但二者在发热呼吸道患者疾病进展的作用，还需要更多研究去证实。HCoV和HRV的Ct值在不同病例类型中分布不同，提示不同类型病例就诊时处于不同病毒载量的感染状态。

青海地区作为一个相对封闭的高原地区，HCoV和HRV有着自己的流行特点。HCoV检出率高，主要分布在夏秋季节，主要流行型别为HCoV⁃OC43／HKU1；HRV全年均可检出，主要分布在春季。总体上，青海地区急性呼吸道感染病例就诊时HCoV及HRV处在不同的病毒载量感染状态。本研究阐明了HCoV及HRV在分子流行病学特点，为青海省急性发热呼吸道感染病例的检测及预防控制提供了依据。

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Molecular epidemiology of human coronavirus and rhinovirus among patients with acute respiratory syndrome in Qinghai Province

Liu Gaoshan，Li Hong，Niu Peihua，Shi Yan，Jiang Shuang Ying，Xu Lili，Lu Roujian，Zhao Shengcang，Tan Wenjie

Key Laboratory of Medical Virology，National Health and Family Planning Commission，National Institute for Viral Disease Control and Prevention，China CDC，Beijing 102206，China（Liu GS，Niu PH，Lu RJ，Tan WJ）；Center for Disease Control and Prevention of Qinghai Province，Xining 810007，China（Li H，Shi Y，Jiang SY，Xu LL，Zhao SC）

Liu Gaoshan and Li Hong are the first author who contributed equally to the article

Tan Wenjie，Email：tanwj28＠yahoo．com；Zhao Shengcang，Email：qhzhaoshengcang＠163．com

Acute respiratory syndrome；Human coronavirus：Human rhinovirus；Quantitative real⁃time reverse transcription polymerase chain reaction；Epidemiology

谭文杰，Email：tanwj28＠yahoo.com；赵生仓，Email：qhzhaoshengcang＠163.com

10.3760／cma.j.issn.1003⁃9279.2016.06.000

急性呼吸道症候群；人冠状病毒，人鼻病毒；荧光定量反转录聚合酶链式反应；流行病学

传染病防治科技重大专项（2013ZX10004601，2014ZX10004001，2012ZX10004⁃208）；国家重点研发计划（2016YFD0500301）

）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the prevalence and molecular epidemiological characteristics of human coronavirus（HCoV）and human rhinovirus（HRV）among patients with acute respiratory syndrome in Qinghai area.MethodsIn total 445 of nasopharyngeal swabs were collected from acute respiratory syndrome group cases in Qinghai during May of 2010 and 2015，six subtypes（⁃OC43，⁃HKU1，⁃229E，⁃NL63，SARS and MERS）of HCoVs and HRV were detected by quantitative real⁃time reverse transcription polymerase chain reaction（qRT⁃PCR）method and related data analyzed.Results34 cases of HCoV were detected in 445 cases（7.64%），of which HCoV⁃OC43 was 19（4.26%），HCoV⁃HKU1 15（3.37%），and the other subtypes were not detected.HRV was detected in 16 cases（3.59%）in 445 cases.The HCoV⁃OC43 positive rate existed statistically significant differences（Fisher’s exact probability P＝0.0011）among different age groups，with a high rate of 9.48%among patients aged 20⁃60 years.The detection rate of HRV（2.45%，6.72%）in inpatient cases was lower than that of in outpatient and emergency cases（Fisher’s exact probability P＝0.0432）.There were significant differences in detection frequencies of HCoV among seasons（χ2＝25.08，P＜0.0001），with HCoV–OC43 predominant in summer（7.20%）and HCoV⁃HKU1 dominating in summer（9.60%）.The detection rate of HRV was also significant differences among seasons（Fisher’s exact probability P＝0.0449），with mainly detected in spring（10.17%）.The median of Ct value of sample with HCoV infection and HRV infection was 36.81（35.54⁃37.49），31.83（27.16⁃33.65），respectively.There was no significant differences of Ct value between inpatient cases and outpatient and emergency cases（）of HCoV infection and HRV infection.ConclusionsThe seasonal distribution characteristic of HCoV and HRV infections can be found，which HCoV peak in summer and HRV dominate in spring.HCoV⁃OC43／HKU1 were main epidemic subtypes of HCoV.The Ct value reveals the divergence of viral load of HCoV and HRV in different case type to some extent.