2014年北京佑安医院手足口病病原谱分析

孙海青 李俊红 张剑 王蕻馨 朱俊萍 娄金丽

100069北京，首都医科大学附属北京佑安医院（孙海青、李俊红、张剑、王蕻馨、娄金丽）；首都医科大学基础医学院病原生物学系（朱俊萍）

2014年北京佑安医院手足口病病原谱分析

孙海青 李俊红 张剑 王蕻馨 朱俊萍 娄金丽

100069北京，首都医科大学附属北京佑安医院（孙海青、李俊红、张剑、王蕻馨、娄金丽）；首都医科大学基础医学院病原生物学系（朱俊萍）

孙海青与李俊红共同第一作者

目的分析首都医科大学附属北京佑安医院2014年手足口病（hand⁃foot⁃and⁃mouth disease，HMFD）的病原谱组成，为HMFD的防治提供科学依据。方法利用LIS系统对北京佑安医院2014年HMFD相关资料进行统计，分析全年HFMD病原谱特征。结合PCR测序及生物信息学分析对部分分型未知肠道病毒（enterovirus，EV）进行核酸分型。结果2014年首都医科大学附属北京佑安医院HMFD确诊病例全年2031例，男女病患比率约1.5∶1。病原谱构成EV⁃A71（34.6%）、CVA16（34.6%）和其他未分型EV（30.8%）。该年度HMFD发病高峰期为4⁃8月，期间HFMD病原谱中EV⁃A71、CVA16和未分型EV的构成比分别为：46.5%／30.8%／22.7%；41.3%／29.6%／29.1%；31.8%／38.4%／29.8%；32.6%／36.1%／31.3%和30.9%／37.4%／31.7%，各月份间差异有统计学意义（χ2＝24.866，P＝0.002＜0.05）。高发期内HFMD患者以5岁以下儿童居多，且年龄越小发病率越高。53例未分型EV经基因测序分析，33例鉴定出型别，其中CVA10、CVA6比例较高，且可引发重症。结论 2014年首都医科大学附属北京佑安医院HFMD病原谱中仍以EV⁃A71和CVA16为主，未分型EV也占据相当比例，且其中CVA10、CVA6检出率较高，并可引发重症。

Fund program：Scientific Research Project of Beijing Educational Committee（KM201410025005）

手足口病（hand⁃foot⁃and⁃mouth disease，HMFD）是由多种肠道病毒（enterovirus，EV）引起的常见感染性疾病，肠道病毒71型（Enterovirus A71，EV⁃A71）和柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16，CVA16）是HFMD最主要的病原体，二者常相伴引起疾病的暴发流行。HMFD多发于5岁以下婴幼儿，主要临床症状包括发热和手、足、口等部位的皮疹、疱疹，伴或不伴口腔溃疡，病情严重者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症。研究发现，80%以上的HFMD重症和死亡病例与EV⁃A71的感染有关［1］。而EV⁃A71也因其与神经系统症状的发生密切相关而成为继脊髓灰质炎病毒之后最受关注的EV。近年来由除EV⁃A71和CVA16外的其他EV感染所引起的HFMD也逐渐被认识和关注。我们对首都医科大学附属北京佑安医院2014年1⁃12月全年HFMD确诊患者资料进行了统计分析，并在该年度HFMD高发期随机抽取未分型EV感染相关的53例HFMD患者咽拭子标本，通过核酸提取、EV基因组保守区扩增以及测序分析进行了EV分型。初步分析了2014年HFMD高发期的其他EV的病原谱特征，为本地区HFMD防控工作的开展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象2014年1⁃12月间首都医科大学附属北京佑安医院门诊及住院部确诊为HFMD的病例。本研究通过首都医科大学附属北京市佑安医院伦理委员会通过，所有患者签署知情书。

1.1.1 病例：诊断标准参照2010年《手足口病诊疗指南》［2］及经分子诊断为EV阳性的病例（荧光探针法）。①普通病例：手、足、口、臀部皮疹，伴或不伴发热。②重症病例：出现神经系统受累表现。精神差、嗜睡、易惊、谵妄；头痛、呕吐；肢体抖动，肌阵挛、眼球震颤、共济失调、眼球运动障碍；无力或急性弛缓性麻痹；惊厥。体征可见脑膜刺激征，腱反射减弱或消失。③危重型：症状：①频繁抽搐、昏迷、脑疝。②呼吸困难、紫绀、血性泡沫痰、肺部啰音等。③休克等循环功能不全表现。

1.2 仪器与试剂检验科分子诊断采用的病毒采样管购自友康生物科技（北京）有限公司，荧光定量PCR扩增仪（CFX96）为美国Bio⁃Rad公司产品，EV核酸检测试剂盒为广州达安生物有限公司产品。实验室采用的病毒RNA提取试剂盒QIAamp Viral RNA Kit购自Qiagen公司、逆转录酶SuperScriptⅡ购自Invitrogen公司、随机引物购自Promega公司、RNA酶抑制剂，高保真DNA聚合酶，dNTP和DTT购自TaKaRa公司。普通PCR仪为美国Bio⁃Rad公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 检验科EV分子诊断分析：按照达安公司试剂盒说明书提取样本RNA，逆转录和利用其自带的EV通用型引物，EV⁃A71和CVA16特异引物进行PCR扩增检测，反应条件：40℃25 min，1个循环；94℃3 min，1个循环；93℃15 s，55℃45 s，40个循环，在55℃时收取荧光。读取结果，检测样本无典型S型曲线或Ct值＞35为阴性，样本呈典型S型曲线且Ct值≤35则为阳性。

1.3.2 未分型EV实验室核酸检测及比对分析：按QIAamp Viral RNA Kit操作指南提取标本中的病毒RNA；逆转录获得病毒基因组cDNA。逆转录体系包括病毒RNA 11 μl、随机引物1 μl、dNTP 1 μl、5倍浓度的反应缓冲液4 μl、0.1 mmol／L的DTT 2 μl、RNA酶抑制剂0.5 μl。反应条件：65℃5 min后加入逆转录酶0.5 μl，25℃，10 min；42℃1 h；70℃10 min。以此cDNA为模板，应用EV通用引物扩增，正向引物5′CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG3′；反向引物5′ATTGTCACCATAAGCAGCCA3′［3］；PCR产物全长435 bp。PCR反应体系为25 μl，包括水18.5 μl、10倍浓度的反应缓冲液2.5 μl，dNTP2 μl，上下游引物各1 μl（100μg／ml），病毒cDNA2 μl，高保真DNA聚合酶0.5 μl。PCR反应条件：94℃2 min，94℃30 s，50℃30 s，72℃1 min，39个循环；72℃5 min，1个循环。PCR产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。PCR产物测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。EV保守区序列经在线比对后进行EV分型。

1.4 统计学方法应用SPSS 17.0统计软件，计数资料进行正态性检验，符合正态性分布采用R×C列联表χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.001为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料2014年全年HFMD确诊病例共2031例，男性1 233例，女性798例，男女之比约为1.5∶1。病原检测结果：EV⁃A71阳性703例（34.6%），CVA16阳性703例（34.6%）和EV分型不明（unkonwn）625例（30.8%）。

2.2 时间分布及HFMD高发期病原谱组成及变化

2014年全年各月均有HFMD发病，其中4⁃8月为发病高峰期，该期总发病例数为1 710，占全年发病总数的84.2%，见图1A。EV⁃A71、CVA16和未分型EV三类病原构成比在HFMD低发的1⁃3月和9⁃12月间变化较大；而在疾病高发期4⁃8月间呈现平稳趋势（图1B，1C）。如图2A所示，2014年HFMD从3月份后发病例数骤升，4⁃8月为发病高峰期，之后病例数骤减，11月份发病人数略有回升之后又趋于回落。4⁃8月间HFMD病原谱EV⁃A71、CVA16和未分型EV的构成比虽呈平缓趋势，但其间差异有统计学意义（χ2＝24.866，P＝0.002）。4月份EV⁃A71构成比最高，达46.5%，之后逐渐下降至6月份的31.8%，随后持平；而此期间CVA16则由4，5月份的30.8%、29.6%攀升至6月份的38.4%，之后趋于平缓；未分型EV从4月份的22.7%上升至5月份的29.1%之后趋于平缓。总体看，2014年HFMD高发期EV⁃A71，CVA16和其他EV检出率比例相近。

图1 2014年全年不同病原HFMD发病情况Fig.1 The incidence of different HFMD pathogens in 2014

2.3 年龄分布如图3所示，2014年HFMD高发期4⁃8月间HFMD患者以5岁以下儿童居多，约占总病例数的85.6%（1464／1710），且随着年龄增长，发病数逐渐下降。

图2 2014全年HFMD病原构成比情况Fig.2 The composition ratio of HFMD pathogens in 2014

图3 2014全年HFMD病原构成比情况Fig.3 The composition ratio of HFMD pathogens in 2014

图4 2014年4⁃8月HFMD患者年龄分布Fig.4 The age distribution of HFMD patients from April to August in 2014

2.4 53例分型未知EV基因测序分析结果 从2014年HFMD高发期随机抽取53例确诊EV阳性但分型未知的HFMD病患进行后续分析。男：女比例约为2：1；其中轻症48例，重症5例。从病患咽拭子提取病毒RNA，逆转录后经EV 5′UTR区基因扩增并测序分析EV分型。其中33例（包括轻症29例和重症4例），分型成功，如图4所示：CVA10，15例（46%）；CVA6，10例（30%）；CVA4，4例（12%）；EV⁃A71，CVA2，CVA5和CVA12各1例（分别占3%）。

29例轻症病例中包括CVA10，14例；CVA6，8例；CVA4，3例；EV⁃A71，CVA12，CVA5和CVA2各1例。4例重症病原分型为CVA6，2例；CVA4和CVA10各1例。

图5 33例其他EV相关HFMD患者病原谱组成Fig.5 The pathogen spectrum of 33 other EV

3 讨论

自2008年以来HFMD的发病和死亡病例数一直位居我国丙类法定传染病之首，疾病的预防和控制成为重要的公共卫生内容。研究发现HFMD可由多种EV引起。而近年我国HFMD病原谱正呈现日益复杂的局面。目前部分HFMD相关病原的疫苗正在研发［4］，中国医学科学院医学生物学研究所的EV⁃A71灭活疫苗已于2016年3月22日在北京市朝阳区正式进行首针接种，但疫苗何时能够实现普种和实际临床疗效尚不清楚。因此持续实施流行病学监测和病原谱特征分析对HFMD防控策略的制定仍然十分重要。

本研究对首都医科大学附属北京佑安医院2014年全年2 031例确诊HFMD患者资料进行了统计分析，发现HFMD全年发病，男女比例约1.5∶1。对发病高峰期4⁃8月间病例进行年龄分析发现：5岁以下儿童为主要发病人群，且年龄越小发病率越高。这些数据均与之前和近期流行病学报告相似［5⁃7］。2014年全年HFMD病原谱构成为：EV⁃A71（34.6%），CVA16（34.6%）和未分型EV（30.8%）。自3月份HFMD病例数明显攀升，EV⁃A71从所占比例最高，经4⁃6月逐渐降低趋于平缓，而此期间CVA16的比例逐渐攀升，呈现此消彼长的态势。其他EV在HFMD高发期早期的病原谱构成中略有增长，随后趋于平缓。ZHU等报告［8］，2007⁃2009三年中北京地区HFMD病原谱构成经历了EV⁃A71构成比由低（19%）到高（56%）再降低（29%）的波动。CVA16和EV⁃A71交替成为年度主要病原。而其他EV构成比则呈现6%到22%及16%的增高及波动。田树萍［9］研究首都医科大学附属北京佑安医院HFMD病原谱构成中，发现相较2011和2012年，2013年中EV⁃A71、CVA16检出率降低，而未分型EV检出率明显升高。我们将2014年统计数据与前两年比较发现：3年间HFMD患者EV⁃A71，CVA16和未分型EV构成比差异有统计学意义（χ2＝653.4，P＜0.001）：2014年EV⁃A71检出率（34.6%）高于2013年（18.5%）但低于2012年（35.3%），CVA16检出率（34.6%）高于2012（22.6%）、2013年（11.5%），未分型EV检出率（30.8%）则低于2012（42.1%）、2013年（70%）（P均＜0.001）。提示近3年来北京地区HFMD病原谱构成波动明显，总体仍以EV⁃A71和CVA16检出为主，与国内大部分地区HFMD主要病原分布趋势相符，但未分型EV占据较大比例，尤其2013年未分型EV出现占比高峰。

中国大陆有记录的HFMD散发和流行从80年代起，早期阶段以CVA16为主要病原，后来CVA16和EV⁃A71伴行，到2008年全国范围内的HFMD大流行以EV⁃A71为主要病原。HFMD流行过程中，除CVA16和EV⁃A71以外，其他类型EV在HFMD病原谱中的占比日益凸显。例如：2001⁃2004年深圳地区HFMD病原谱中CVA16，EV⁃A71和其他EV三者比例约为2：1.2：1。2007年山东临沂HFMD大流行中其他型别EV仅占病原谱的2%［10］，而该地区2009⁃2011年其他型别EV比例从21%升至49%［11］。不仅如此，在近年HFMD流行中其他EV的种类也明显增加，包括：CVA2、4⁃6、9、10、12，CVB1、3⁃5和ECHO6、7、11、13、19、25、30等［10⁃13］。柴青等［14］发现，2010⁃2012年青岛地区HFMD病原除主要的EV⁃A71和CVA16外，其他共流行EV中CVA10检出率明显增高。深圳2009⁃2013年HFMD数据［15］显示，2010年以后轻症HFMD主要由CVA6感染引起，EV⁃A71、CVA16逐渐被取代。而Wei等［16］发现浙江医科大学儿童医院2010⁃2012年间HFMD病原中由其他未分型EV引起病毒性脑炎和疱疹性咽峡炎的病例逐渐上升。提示未分型EV在HFMD发病中的作用不容忽视，明确EV分型也愈发重要。为此我们选取2014年HFMD高发期部分未分型EV进行了检测，发现该时段内未分型EV病原中以CVA10为主，占可分型病例的46%；其次是CVA6，占30%；再次是CVA4，占12%；另有少量CVA2，CVA5和CVA12等。初步显示北京佑安医院2014年HFMD发病高峰期未分型EV呈现一定多样性，且以柯萨奇病毒A组成员为主，尤其是CVA10和CVA6。其中4例重症的EV分型分别为：CVA6，2例；CVA4和CVA10各1例。提示2014年北京佑安医院由其他EV引起的HFMD不仅占据一定比例（30.8%），且在疾病高发期呈现多样性，其中为主的CVA10、CVA6还可引起重症。2013年北京地坛医院的报告［17］指出，HFMD病原谱中CVA6占43%，成为最主要的病原体，远远超过EV⁃A71（14.8%）和CVA16（3.9%）。与近年CVA6在我国多地HFMD暴发流行中成为主要病原趋势相仿［18，19］。综上提示近年北京地区及全国范围内HFMD持续高发期间病原谱变化明显，非EV⁃A71和CVA16的其他EV病原比例及多样性日益增加，并与重症发生有关，应引起足够重视。尤其在疾病高发期，多种病原共流行的状况可为EV间的重组变异提供有利条件。近年来，HFMD相关EV种内或种间发生基因重组的报道屡见不鲜［20］。

另外，该研究中发现的2014年北京地区HFMD流行病学的时间分布特征与之前报告基本相符，春夏高发，同一年不同月份及不同年份中优势流行毒株此消彼长，交替成为病原谱中的主要流行毒株。尤其值得关注的是2014年HFMD春夏高发期过后，9月和12月出现两次病原谱中其他EV构成比的高峰。推测秋冬季的储备可能为来年其他EV多样性的增加提前做了准备。因此应持续观察该其他EV相关的构成比小高峰是否持续稳定存在，尤其不能忽视对其他EV多样性的持续监测。鉴于病原谱的复杂多变及EV重组现象的普遍存在，适时建立精确、全面的EV分型及重组监测的方法，检测相关病原的分子进化对HFMD的有效防控是非常必要的。

［1］ Zhang Y，Tan X，Cui A，et al.Complete genome analysis of the C4subgenotypestrainsofenterovirus71：predominant recombination C4 viruses persistently circulating in China for 14 years［J］.PLoS One，2013，8（2）：e56341.doi：10.1371／journal.pone.0056341.Epub 2013 Feb 18.

［2］ 中华人民共和国卫生部.手足口病诊疗指南（2010年版）.国际呼吸杂志，2010，30（24）：1473⁃1475.doi：10.3760／cma. j.issn.1673⁃436X.2010.024.001.

［3］ Hafliger D，Gilgen M，Lüthy J，et al.Seminested RT⁃PCR systems for small round structured viruses and detection of enteric viruses in seafood.J Food Microbiol，1997：27–36.doi：10.1016／S0168⁃1605（97）00041⁃X.

［4］ HouW，YangL，HeD，etal.Developmentofa coxsackievirusA16 neutralization test based on the enzyme⁃linked immunospot assay［J］.Journal of Virological Methods，2015，215⁃216：56⁃60.doi：10.1016／j.jviromet.2015.02.010.Epub 2015 Feb 19.

［5］ 王经伟，高帅，高峰，等.临沂地区1426例手足口病流行病学及临床特征分析［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2013，6（27）：417⁃419.doi：10.3760／cma.j.issn.1003⁃9279.2013. 06.006.

［6］ Zhang W，Huang B，She C，et al.An epidemic analysis of hand，foot，and mouth disease in Zunyi，China between 2012 and 2014［J］.SaudiMedJ，2015，36（5）：593⁃598.doi：10.15537／smj.2015.5.10859.

［7］ Huang XY，Wei HY，Wu SY，et al.Epidemiological and Etiological Characteristics of Hand，Foot，and Mouth Disease in Henan，China，2008–2013［J］.Sci Rep，2015，5：8904. doi：10.1038／srep08904.

［8］ Zhu JP，Zhen L，Wang J，et al.Phylogenetic analysis of enterovirus 71 circulating in beijing，china from 2007 to 2009［J］.PLoS One，2013，8（2）：e56318.doi：10.1371／journal. pone.0056318.Epub 2013 Feb 13.

［9］ 田树萍，何菡，王文静，等.2011⁃2013年手足口病病原谱及临床特征分析［J］.北京医学，2014，36（6）：447⁃449.doi：10.15932／j.0253⁃9713.2014.06.018.

［10］ Zhang Y，Tan X J，Wang H Y，et al.An outbreak of hand，foot，and mouth disease associated with subgenotype C4 of human enterovirus 71 in Shandong，China［J］.J Clin Virol，2009，44（4）：262⁃267.doi：10.1016／j.jcv.2009.02.002.Epub 2009 Mar 9.

［11］ Du J，Wang X，Hu Y，et al.Changing aetiology of hand，foot，and mouth disease in Linyi，China，2009⁃2011［J］.Clin Microbiol Infect，2014，20（1）：47⁃49.doi：10.1111／1469⁃0691.12301. Epub 2013 Aug 1.

［12］ Xu M，Su L，Cao L，et al.Enterovirus genotypes causing hand，foot，and mouth disease in Shanghai，China：a molecular epidemiological analysis［J］.BMC Infect Dis，2013，13：489. doi：10.1186／1471⁃2334⁃13⁃489.

［13］ 朱俊萍，徐子刚，陈辉，等.2007年北京地区儿童手足口病病原的初步筛查［J］.病毒学报，2009，25（1）：23⁃28.doi：10.13242／j.cnki.bingduxuebao.001964.

［14］ 柴青，宫金伶，赵丹，等.2010⁃2012年青岛地区手足口病病原谱及柯萨奇CA10型的分子流行病学研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2014，34（10）：731⁃736.doi：10.3760／cma. j.issn.0254⁃5101.2014.10.001.

［15］ Huang Y，Zhou YP，Lu H，et al.Characterization of Sever Hand，Foot，and Mouth Disease in Shenzhen，China，2009–2013［J］. Journal of Medical Virology，2015，1⁃9.doi：10.1002／jmv. 24200.Epub 2015 May 7.

［16］ Li W，Zhang X，Chen X，et al.Epidemiology of childhood enterovirus infec⁃tions In Hangzhou，China［J］.Virol J，2015，12（1）：58.doi：10.1186／s12985⁃015⁃0294⁃4.

［17］ Gu H Y，Ma C J，Yang Q Z，et al.Hand，foot and mouth disease caused by coxsackievirus A6，Beijing，2013［J］.Pediatr Infect DisJ，2014，33（12）：1302⁃1303.doi：10.1097／INF.0000000000000467.

［18］ Han J F，Xu S，Zhang Y，et al.Hand，foot，and mouth disease outbreak caused by coxsackievirus A6，China，2013［J］.J Infect，2014，69（3）：303⁃305.doi：10.1016／j.jinf.2014.03.015. Epub 2014 Apr 2.

［19］ Tan X，LiL，ZhangB，etal.Molecularepidemiologyof coxsackievirus A6 associa⁃ted with outbreaks of hand，foot，and mouth disease in Tianjin，China，in 2013［J］.Arch Virol，2015，160（4）：1097⁃1104.doi：10.1007／s00705⁃015⁃2340⁃3.Epub 2015 Feb 15.

［20］ 赵奇，朱俊萍.中国手足口病的流行状况及病原谱变化分析［J］.病毒学报，2015，31（5）：554⁃559.doi：10.13242／j.cnki. bingduxuebao.002776.

The pathogen spectrum analysis of HFMD in 2014 in Beijing Youan Hospital，

Sun Haiqing，Li Junhong，Zhang Jian，Wang Hongxin，Zhu Junping，Lou Jinli

Beijing Youan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100069，China（Sun HQ，Li JH，Zhang J，Wang HX，Lou JL）；Department of Medical Microbiology，School of Basic Medical Sciences，Capital Medical University，Beijing 100069，China（Zhu JP）

Sun Haiqing and Li Junhong，are the first author who contributed equally to the article

Zhu Junping，Email：jpzhu＠ccmu．edu．cn；Lou Jinli，Email：13718641405＠163．com

ObjectiveTo analyze the pathogen spectrum of hand⁃foot⁃and⁃mouth disease（HMFD）in 2014 in Beijing Youan Hospital for providing scientific basis for the prevention of HFMD.MethodsThe related data of HFMD in 2014 was analyzed by LIS system，including the characteristics of pathogen spectrum.The other enterovirus（EV）was partially identified by DNA sequencing analysis.ResultsThe number of confirmed HMFD cases in 2014 was 2031，and the proportion of male and female patients was about 1.5∶1.The pathogen spectrum of HMFD was EV⁃A71（34.6%），CVA16（34.6%）and other EV（30.8%）.The HMFD peak of incidence was from April to August in 2014.During the period，the compositionratios of EV⁃A71，CVA16 and other enterovirus were respectively 46.5%／30.8%／22.7%；41.3%／29.6%／29.1%；31.8%／38.4%／29.8%；32.6%／36.1%／31.3%和30.9%／37.4%／31.7% in each month.The difference among them was statistically significant（chi⁃square＝χ2＝24.866，P＝0.002＜0.05）.During the period of high incidence of HFMD，the predominant patients were the children under five years old，the younger the age，the higher the incidence rate.ConclusionsThe major causitive agents of HFMD in 2014are still EV⁃A71 and CVA16.The other EV encounters a considerable proportion and the incidence of CVA10 and CVA6is relatively higher，which could cause severe cases of HFMD.

Hand⁃foot⁃and⁃mouth disease；Epidemiology；Pathogen spectrum

朱俊萍，email：jpzhu＠ccmu.edu.cn；娄金丽，Email：13718641405＠163.com

10.3760／cma.j.issn.1003⁃9279.2016.06.000

手足口病；流行病学；病原谱

北京市教委科研计划项目（KM201410025005）

2016⁃04⁃26）