金纳米团簇标记PLGA支架的研究

王祥盛 王贤松 张智勇 周广东 刘 伟 曹谊林 张文杰

·论著·

金纳米团簇标记PLGA支架的研究

王祥盛 王贤松 张智勇 周广东 刘 伟 曹谊林 张文杰

目的探讨金纳米团簇用于示踪可降解高分子支架的可行性，为非侵入成像方式监测体内组织工程支架降解提供方法和思路。方法用氯金酸和牛血清白蛋白（BSA）为原料合成金纳米团簇（Au Nanoclusters，AuNCs），进行相关表征及细胞毒性检测。以AuNCs标记聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），制备AuNCs/PLGA支架，扫描电镜检测支架表面结构，荧光及CT扫描检测支架特性。将支架植入裸鼠皮下，应用荧光成像及Micro-CT扫描，以观测支架在体内的情况。结果合成的AuNCs具有荧光特性，无细胞毒性；纳米团簇标记的PLGA支架保持荧光特性，同时在CT扫描中可显影；AuNCs/PLGA支架可以在裸鼠皮下通过荧光成像及Micro-CT扫描来示踪。结论AuNCs可作为组织工程支架的示踪剂，为非侵入成像方式监测体内高分子组织工程支架降解情况提供可能。

金纳米团簇支架材料非侵入成像

理想的组织工程支架材料的重要特征之一，是具有与组织形成相匹配的降解速率[1]。因此，无创且动态监测支架材料的降解是一个亟待解决的难题。非侵入成像技术（Non-invasive Imaging Technology，NIR）包括CT、MRI和荧光光学成像等技术，为无创动态监测体内组织工程支架材料的降解提供了可能性。然而，生物大分子和高分子聚合物等组织工程支架常用材料，无法采用上述方法成像或显影。因此，需要开发一种能长期标记支架材料的“造影剂”，用于非侵入成像技术，以此来达到无创监测体内组织工程支架降解的目的。

金纳米团簇（Au Nanoclusters，AuNCs）是一种新型的荧光纳米材料，生物毒性小，具有稳定的激发荧光，和良好的X线衰减效应[2]。本实验中，我们利用牛血清白蛋白（BSA）和氯金酸（HAuCl4）为原料，合成BSA包裹的金纳米团簇，验证其光学特性和生物毒性，并用该团簇标记组织工程常用的高分子材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA），利用荧光成像和CT扫描等方式，监测该支架在动物体内的情况，探讨利用金纳米团簇来示踪组织工程支架的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

主要试剂：氯金酸（HAuCl·43H2O，99%）、牛血清白蛋白（BSA）、1.4-二氧六环（国药集团上海化学试剂有限公司）；PLGA（50∶50，Mw 38 000～54 000）（Sigma，美国）。

主要仪器：Micro-CT（Scanco Medical，美国）；小动物成像仪（PerkinElmer，美国）；扫描电镜（Phenom，荷兰）；紫外分光光度计（Beckman，美国）；酶标光度计（Thermo，美国）。

实验动物：6周龄BALB/c裸鼠6只（本院SPF级动物实验中心提供）。

1.2 金纳米团簇的合成与表征

1.2.1 金纳米团簇的合成

在搅拌条件下，将BSA溶液（10 mL，25 mg/mL）加入到氯金酸溶液（10 mL，10 mM）中，加入NaOH溶液（1 mL，1 mol/L），继续搅拌1 h后停止，然后使混合溶液在37℃温度下孵育12 h，即可得到稳定的金纳米团簇溶液。

1.2.2 金纳米团簇的表征

以高分辨率透射电镜观察合成的金纳米团簇粒子的形貌及粒子大小。用紫外分光光度计测定金纳米团簇的吸收光谱，其光谱测量范围为400～700 nm。用酶标光度计测其在440 nm激发光下的荧光发射光谱。高分辨率扫描电镜测其粒子的形貌。

1.2.3 金纳米团簇的毒性测定

利用人脐静脉内皮细胞系（HUVEC，来源于本实验室）检测金纳米团簇的细胞毒性。将HUVEC以10 000个/孔的密度均匀接种于iCELLigence实时细胞检测仪的培养板里，实验组中加入1 000 nM的金纳米团簇溶液，对照组中加入同量的PBS溶液。细胞检测仪检测第1、2、3、4、5天的细胞的指数。

1.3 支架制备与表征

将合成好的金纳米团簇冻干制成粉末，取20 mg加入到1 mL的1.4-二氧六环中，经超声震荡使其充分分散，再加入100 mg的PLGA，搅拌2 h。经冻干成型后得到多孔的AuNCs/PLGA支架。同样通过冷冻干燥法制备单纯的PLGA支架。将两种材料制备成直径10 mm，厚2 mm的圆片。60Co消毒备用。将上述方法制备得到的两种支架喷金镀膜，扫描电镜下观察。利用365 nm便携式紫外灯照射两种支架，检测其荧光情况，同时用Micro-CT来扫描两种支架，观察在CT中的显影情况，并测量CT值。

1.4 支架植入裸鼠皮下

腹腔麻醉后，在裸鼠后背正中近尾端处作1 cm长的直线切口，并钝性分离皮肤与皮下组织，将消毒好的AuNCs/PLGA支架植入左侧，单纯的PLGA支架植入右侧。术后切口处涂抹红霉素软膏预防感染。共植入6只裸鼠。

1.5 荧光成像和Micro-CT扫描

支架植入后第三天，将裸鼠吸入麻醉后置入小动物成像仪中，检测皮下支架的荧光情况，并荧光成像拍照和测算其荧光强度。以此时间点为第一周，此后每周同一时间点监测支架的荧光情况，连续监测5周。分别记录每周支架的荧光成像结果和荧光强度数值。制作荧光强度随时间变化的曲线。

1.6 统计分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，实验组与对照组的比较采用配对t检验及方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 金纳米团簇的合成和表征

金纳米团簇在正常光下呈棕黄色，365 nm便携式紫外光照下呈现红色荧光。透射电镜结果显示，合成的金纳米团簇颗粒呈大小分布均匀的球状粒子，平均粒径约为3 nm，这与相关报道基本一致[3]。金纳米团簇在400～700 nm的吸收光谱和在激发光为440 nm下的荧光光谱显示，该纳米团簇在520 nm处呈特征吸收峰；当以440 nm为激发波长时，可发现金纳米团簇的发射波峰位于700 nm附近，符合红色荧光的波长范围（图1）。

2.2 金纳米团簇的细胞毒性

第1～5天实验组和对照组的细胞指数显示，金纳米团簇溶液（实验组）中HUVEC的细胞指数分别是PBS溶液（对照组）的99.8%、102.0%、104.5%、105.9%和105.4%，平均相对增殖率是103.5%，其中第2～4天，实验组与对照组差异明显（P＜0.05），第1和5天，实验组与对照组无显著差异（P＞0.05）。依据细胞相对增殖率与细胞毒性分级关系，金纳米团簇溶液在第1、2、3、4、5天的细胞毒性分别是I级、0级、0级、0级和0级，说明金纳米团簇对细胞无毒性（图2）。

2.3 支架制备和表征

通过冷冻干燥法制备AuNCs/PLGA和单纯的PLGA支架，均为圆盘状，直径10 mm，厚度2 mm，其中AuNCs/PLGA支架外观呈淡粉色，而单纯PLGA支架外观呈白色。扫描电镜观察发现，两种支架的孔径都在50 μm左右，孔隙分布不均匀。用激发波长为365 nm的紫外光照射两种支架，可以发现单纯PLGA呈现紫蓝色，无激发荧光；而AuNCs/ PLGA支架则呈较为均匀的红色荧光。Micro-CT扫描两种支架，可以发现单纯PLGA支架基本不显影，而AuNCs/PLGA支架则为均匀的高密度影；AuNCs/ PLGA支架的CT值为200 HU，高于软组织（20～50 HU）或内脏器官（40～100 HU）（图3）。

2.4 荧光和CT双模式成像结果

分别在同一只裸鼠的皮下植入两种支架，单纯PLGA支架植入右侧，AuNCs/PLGA支架植入左侧。应用小动物成像仪检测材料荧光情况，可以看到全部6只裸鼠的AuNCs/PLGA支架可有明显的荧光成像，而单纯PLGA支架无荧光成像。Micro-CT扫描重建可见AuNCs/PLGA支架显影清晰，与周围软组织区分明显，而单纯PLGA支架基本不能显影，无法和周围软组织鉴别。通过三维重建，可以看到AuNCs/PLGA支架的精确三维结构。这表明通过标记金纳米团簇于PLGA支架上，不仅可以通过荧光强度来监测材料的状态，还能通过CT成像了解支架在体内的三维结构和形态变化（图4）。

图1 金纳米团簇的表征Fig.1Characterization of AuNCs

图2 HUVEC在AuNCs作用下的生长曲线Fig.2The growth curves of HUVEC coincubation with AuNCs in the cell medium

图3 单纯PLGA支架和AuNCs/PLGA支架大体观及表征Fig.3Gross observation and Characterization of PLGA and AuNCs/PLGA scaffolds

图4 体内支架荧光变化（5周）Fig.4 Fluorescence change of scaffold in vivo within 5 weeks

3 讨论

传统组织工程支架降解的研究通常采用组织切片染色法，以确定支架材料的降解和组织再生情况，无法实现同一动物体内的连续观察，且不适用于临床研究。目前，快速发展的非侵入成像技术（Noninvasive Imaging Technology，NIR），包括CT、MRI和荧光光学成像技术[3]，为动态监测体内组织工程支架材料降解提供了可能。然而，生物大分子或高分子聚合物等组织工程支架材料，无法采用上述方法成像或显影。Natalie等[4]通过有机荧光染料标记可降解支架材料聚乙二醇（PEG），并在大鼠模型上成功实现荧光光学成像。但是，有机染料在生物体内长时间应用过程中，存在荧光信号不稳定，甚至淬灭等问题，不适合作为体内长期研究的荧光探针，因而限制了荧光成像技术在支架材料研究领域的应用[5-6]。Kim等[7]通过两性离子近红外荧光纳米分子探针，标记胶原支架，并对其进行了长时间小鼠体内近红外荧光成像。结果表明，荧光成像可以实时示踪胶原支架在体内代谢的动态过程。然而荧光分子探针和荧光成像系统虽然能对支架材料的降解情况在细胞、分子水平上进行示踪，具有很高的灵敏度，但是只能平面成像，无法获得活体三维结构。同时，荧光探针在代谢时有可能被周围细胞吸收，从而进入新生组织中，荧光残留其中时，无法区分新生组织的残留荧光和原支架材料荧光。而Micro-CT成像技术刚好可以解决荧光成像的不足，与荧光成像技术构成互补，能弥补荧光成像无法获取的支架材料三维空间结构信息。Micro-CT成像具有较高的时间和空间分辨率，安全可靠。更为重要的是，Micro-CT能区分新生组织里的残留荧光和原支架材料荧光。如果生物体内的支架材料能够同时进行荧光成像和Micro-CT双模式成像，则可以顺利对支架材料的降解和组织再生进行动态监测。然而，Micro-CT成像对密度低的高分子材料或聚合物等成像效果差，与组织之间无法区分，甚至不能成像。因此，开发“支架材料造影剂”，使其具有荧光成像特性，且能提高Micro-CT材料三维空间上的分辨率具有重要意义。

金纳米团簇是一种新型的荧光纳米材料，是在分子层保护下，由几个到几百个金原子组成的相对稳定的聚集体，相比小分子荧光染料和量子点，金纳米团簇具有毒性低、表面易于修饰、荧光稳定性强且可调、Stokes位移大等优点[8]。同时，由于金元素比碘元素具有更高的原子序数和X线衰减特性，故在X线成像中具有更高的增强效应[9]。金纳米团簇在小动物血管造影和肿瘤成像中都具有良好的成像效果[10]。

本实验中，我们利用无细胞毒性的牛血清白蛋白作为包裹分子，来合成金纳米团簇，同时我们选用目前广泛使用的、非侵入成像技术无法显影和监测的支架材料PLGA作为研究对象[11]。我们发现，合成的金纳米团簇，具有强烈的红色激发荧光。红色荧光具有波长较长、易于穿透生物体、能避免生物体内自发荧光干扰的优势。同时，金纳米团簇能明显提高PLGA的密度，在CT扫描下具有良好的成像效果，能与周围软组织明显区分。本实验中合成的金纳米团簇无细胞毒性，可用于体内实验。基于以上实验结果，我们认为金纳米团簇可作为标记支架材料的特殊“造影剂”，结合近红外荧光和Micro-CT双模式成像，可建立无创动态监测体内支架材料降解的模型。

我们认为，金纳米团簇可以监测支架的降解，随着支架材料在体内的降解，解体的材料单体和荧光纳米探针将被释放和清除，修复区域的荧光会越来越弱，密度也会逐渐降低，直至支架完全降解而消失，此时降解区会形成荧光空洞，并且通过CT扫描后的三维重建，可以看到具体形态的变化。

虽然在本实验中已经验证了合成的金纳米团簇可以标记组织工程支架，并且能通过荧光成像和CT扫描的方式检测其在体内的情况，然而在实际的降解过程中，荧光强度的变化、CT成像的变化是否与支架降解的实际情况相一致，即该方法的精确度，还需通过进一步的实验来加以验证。

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[11]Lu L,Peter SJ,Lyman MD,et al.In vitro and in vivo degradation of porous poly(DL-lactic-co-glycolic acid)foams[J].Biomaterials, 2000,21(18):1837-1845.（收稿日期：2016年9月4日；修回日期：2016年10月26日）

Labeling PLGA Scaffold with Gold Nanoclusters

WANG Xiangsheng,WANG Xiansong,ZHANG Zhiyong,ZHOU Guangdong,LIU Wei,CAO Yilin,ZHANG Wenjie.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering, Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200240,China.Corresponding author: ZHANG Wenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of using Au nanoclusters(AuNCs)to label the tissue engineering scaffold which degradation could be further monitored by noninvasive approach in vivo.MethodsChlorauric acid and bovine serum albumin(BSA)were used to synthesize AuNCs.The nanoclusters were characterized and their cytotoxicity was evaluated. AuNCs were then mixed with poly lactic-co-glycolic acid(PLGA)to fabricate AuNCs/PLGA scaffold.The scaffolds were implanted subcutaneously in nude mice.Fluorescence imaging and CT scanning were performed to detect the scaffolds in vivo.ResultsSynthesized AuNCs possess fluorescence without cytotoxicity.The AuNCs labeled PLGA scaffolds were detected by fluorescence imaging and CT scanning in vitro.The scaffolds were detected by these two noninvasive methods after being implanted in nude mice.ConclusionAuNCs could be potentially used for labeling polymer scaffold,which degradation could be possibly monitored by non-invasive imaging technology.

Au nanoclusters;Scaffold;Non-invasive imaging

Q813.1+2

A

1673－0364（2016）06－0331－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.001

国家自然科学基金（81271714，31170944）；上海市科委基础重点研究项目（15JC1490600）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科，上海市组织工程研究重点实验室；200240上海市组织工程国家工程中心。

张文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。