结肠癌干细胞特征及生物学行为研究进展

陈方军　刘玉兰　张育军　孙国平

(安庆医药高等专科学校临床医学系，安徽　安庆　246052)

结肠癌干细胞特征及生物学行为研究进展

陈方军刘玉兰1张育军1孙国平2

(安庆医药高等专科学校临床医学系，安徽安庆246052)

〔关键词〕结肠癌;干细胞;增殖;转移

由于结肠癌早期缺乏症状难以诊断，发现时多已进入晚期，预后差、存活率低。结肠癌组织中存在一小部分具有诱导肿瘤发生、增殖，促进肿瘤迁徙、转移的特殊细胞，称为结肠癌干细胞(CCSCs)，研究CCSCs的相关生物学特征，可以为结肠癌的诊断、治疗、预防提供一种全新的手段。

1CCSCs的特征

肿瘤干细胞目前已被认为是肿瘤发生、发展、转移和药物抵抗的重要原因，了解CCSCs的特性有助于分离CCSCs并研究其与肿瘤相关的生物学行为。

1.1CCSCs与非CCSCs之间的转化细胞类型的可塑性在特定条件下可引起肿瘤干细胞和非干细胞之间的相互转化。Schwitalla等〔1〕发现在炎性肿瘤微环境中,核因子(NF)-κB通过活化的Wnt信号通路，诱导非干细胞去分化，从而使组织获得肿瘤发生的能力，而特定的肠上皮细胞RelA/p65(NF-κB亚单位)的消除可阻断肠腺窝干细胞的扩增,这说明体内炎症信号对CCSCs的产生和去分化的作用。Yang等〔2〕也发现CCSCs和非CCSCs在正常和辐射环境中存在固有的相互转换和动态平衡，转化生长因子(TGF)-β可能通过激活上皮间充质转化在平衡中扮演重要角色。

1.2CCSCs的标志物有研究通过蛋白质组分析结肠癌细胞株SW1116中有包括CD133和CD29在内的10个蛋白斑点被识别〔3，4〕，在细胞株HCT116 和SW480上有CD24表达〔5〕，DLD-1细胞株上表达CD133、 CD166、 G蛋白耦联受体(LGR)5和乙醛脱氢酶(ALDH)〔6〕。具有这些标志物的细胞群具有干细胞特性，在体外和体内表现出更强的肿瘤生成、迁移、侵袭及化学抵抗能力。研究发现，LGR5抗体在正常组织中不被染色，在高分化肿瘤的癌细胞中有单个或多达4个干细胞簇被染色，在低分化肿瘤中有9～81个干细胞簇被染色〔7〕；在伊立替康存在的环境下，LGR5的表达改变可引起CCSCs在增殖和抗药状态下发生相互转化。这些结果显示不同群集的干细胞数量和标志物的表达改变可导致肿瘤等级的重构〔8〕。细胞凋亡相关核蛋白PHLDA1在结肠癌中表达也很广泛，在肿瘤侵袭的边缘常有增强表达和核定位。小干扰RNA(siRNA)介导的PHLDA1抑制可阻止结肠癌细胞体外迁移、锚定非依赖性生长及体内肿瘤的生成，提示PHLDA1也可能是人肠组织潜在的上皮干细胞标志物〔9〕。

2CCSCs的增殖、分化和转移

2.1CCSCs的增殖对结肠癌ALDH+CCSCs细胞群研究发现，胰岛素样生长因子(IGF)-1在β-连环蛋白(catenin)依赖的方式下可使丝/苏氨酸激酶(AKT)组成性激活突变体过表达导致干细胞数量增多，而IGF-1抗体Cp-751,871可减少干细胞数量，抑制肿瘤生长〔10〕；此外，Lin等〔11〕发现ALDH+/CD133+CCSCs表达高水平的磷酸化信号转导和转录活化因子(STAT)3，姜黄素及类似物GO-Y030可抑制这种改变,减少STAT3下游靶基因表达，从而诱导CCSCs凋亡，抑制肿瘤形成。另有研究显示白细胞介素(IL)-6可通过诱导细胞株HCT-116和HT-29CCSCs Notch-1和CD44的表达，增强这两种细胞株的肿瘤生成能力〔12〕；干扰素(IFN)-γ和肿瘤细胞坏死因子(TNF)-α也可刺激C26结肠癌小鼠CCSCs加速肿瘤的生长,通过siRNA抑制CCSCs中的低氧诱导因子(HIF)-1α信号通路则能有效降低CCSCs在体内炎性环境中的致瘤能力〔13〕。Leng等〔6〕则发现DLD-1细胞株中过度表达的kruppel样转录因子(KLF)4，能诱导体细胞产生多能干细胞，促进体内外的肿瘤生成。

Yap多肽的高水平是促使CCSCs增殖的必需因素，Zhou等〔14〕研究显示71例结肠癌病例中有68例高表达Yap，36个结肠癌细胞株中至少有30个高表达Yap，这可引起肠组织干细胞群扩大，促使癌细胞增殖，而Yap的消除可减弱β-catenin和Notch信号传导，抑制细胞增殖和生存，在 HCT116细胞株中，同样发现表皮生长因子(EGF)对维持干细胞增殖是必需的，通过抑制EGF受体(EGFR)的自身磷酸化和下游信号通路蛋白AKT、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2能抑制CCSCs增殖，诱导CCSCs的凋亡〔15〕。Shenoy等〔16〕通过Wnt通路报告实验分离了溃疡性结肠炎(UC)病人具有高度Wnt活性的ALDH+CCSCs，研究评估了Wnt/β-catenin信号通路与结肠炎向癌转化(CCT)之间的机制，发现20个CCSCs单细胞注射后，有5个可引起组织肿瘤形成，显示CCSCs具有高度的克隆和致瘤潜能。Múnera等〔17〕发现初生小鼠结肠上皮细胞中Est2基因的条件性失活可使小鼠结肠隐窝过度表达，引起黏膜厚度增加、杯状细胞数量增多，这种选择性隐窝群分化状态的改变提示Ets2缺陷改变了CCSCs的数量和行为，导致肿瘤的发生。

2.2CCSCs的分化DNA5′端甲基化是与组织分化相关的一种重要表观修饰，5 mC在与TET蛋白家族成员相关的酶促反应中被转化成5hmC(5-hydroxymethylcytosine)。研究发现5hmC在鼠和人正常结肠组织中含量丰富，而在结肠癌组织中显著减少，显示5hmC在组织分化中的重要作用〔18〕。另有研究观察了25例肿瘤样本中表达CD133的CCSCs，发现骨形成蛋白(BMP)4激活包含磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB)/AKT的BMP信号通路，促进了CCSCs的终末分化、凋亡〔19〕。Merlos-Suárez等〔20〕则通过流式细胞术发现免疫缺陷性小鼠的CCSCs高表达酪氨酸蛋白激酶受体EphB2，表现出强大的肿瘤生成和长期自我更新潜能，但在细胞分化中逐渐沉默。

2.3转移Dieter等〔21〕发现肿瘤起始细胞(TICs)存在细胞异质性，具有维持连续异种移植肿瘤形成的长期的(LT)-TICs主要储存在骨髓中，不断更新的LT-TICs促使肿瘤转移的发生。高迁移率蛋白(HMG)A1是结肠癌细胞转移分子机制中关键的转录因子。Belton等〔22〕发现在转基因小鼠中HMGA1诱导CCSCs表达Twist1蛋白，抑制E-cadherin的表达，促进肿瘤转移发生和发展；而HMGA1的敲除阻断肿瘤细胞的锚定非依赖性生长、移植瘤的发生，也抑制体内肝转移的发生。结肠癌的肝转移现象还与TGFβ的参与有关，Zubeldia等〔23〕将Mc38-luc TGFβ细胞注射到小鼠脾脏，发现TGFβ促进原发肿瘤的生长和肝转移的发生，这可能与TGFβ引起Mc38细胞Smad2、Smad3和Smad1/5/8活化，增强细胞侵袭和跨内皮迁移能力有关。另有研究发现结肠癌细胞株(HT29 和HCT-116)CCSCs分泌的高水平纤溶酶原激活抑制物(PAI)-1可显著刺激这两种细胞株迁移，而针对PAI-1的抗体能阻断这种效应〔24〕。

对人结肠癌HT29细胞株CD133+CCSCs的微小RNA(miRNAs)表达谱进行研究，发现有11种过表达和8种低表达的miRNAs，如miR-429,miR-155,and miR-320d，而SW1116 CD133+/CD44+CCSCs则有31种上调和31种下调的miRNAs，如miR29a,miR29b,miR449b and miR4524。基因本体和通路分析显示这些表达差异的miRNAs可进一步调节CCSCs信号通路、细胞骨架及膜蛋白表达，从而赋予CCSCs复发和转移的生物学行为〔25,26〕。

3治疗与预后

3.1CCSCs的治疗化学抵抗是结肠癌药物治疗效果低下的主要原因，而众多研究显示CCSCs与结肠癌的化学抵抗关系密切。Chen等〔27〕发现ALDH1+HT29和HT29-taxol细胞株低表达miRNA125a/b，高表达ALDH1A3和Mcl1，这种miRNA125a/b引起ALDH1A3和Mcl1基因表达上调的机制提高了细胞生存能力，减少细胞凋亡，使CCSCs在化学抵抗中发挥关键作用。Wu等〔28〕对由CCSCs引发的免疫缺陷小鼠结肠肿瘤给予BMP4，发现BMP4可减弱肿瘤对治疗的化学抵抗，增强5-Fu和奥沙利铂的抗肿瘤效应；O′Brien等〔29〕发现沉默分化抑制因子ID1和ID3也可提高干细胞对化疗药物奥沙利铂的敏感性；van Houdt等〔30〕则发现凋亡蛋白抑制剂BIRC6是伴肝转移结肠癌病人CCSCs对奥沙利铂和顺铂抵抗的重要调节因子，针对BIRC6的治疗可能有助于消除CCSCs。另有研究显示，表达同源异型盒基因cdx1的SW1222细胞株对紫杉醇诱导的细胞毒性有显著抵抗，这与cdx1、bcl-2的表达、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3活力、微管相关蛋白(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例上调有关，cdx1的沉默和溶酶体抑制剂bafilomycinA的治疗能提高紫杉醇诱导的细胞毒性，cdx1 siRNA的瘤内注射可显著抑制接种cdx1癌细胞的移植瘤生长〔28〕。Bitarte等〔31〕对以伊立替康为基础的一线药物治疗没反应的结肠癌患者观察发现，具有干细胞特性的结肠癌球中miRNA451表达下调，而miRNA451的恢复可减少三磷酸腺苷结合转运蛋白(ABC)B1基因的表达，导致癌细胞对伊立替康敏感，这个结果提示miRNA451是结肠癌病人发生药物抵抗的一个重要因素。另有研究发现将表达特异肿瘤相关抗原Cep55来源的抗原蛋白Cep55/c10orf3_193 的CTL克隆41进行过继转移，可显著抑制对化疗药物伊立替康、依托泊甙抵抗的SW480细胞株CCSCs的增殖，提示Cep55/c10orf3-193蛋白为基础的癌症疫苗治疗或者CTL的过继转移是治疗有化疗抵抗的CCSCs的一种可行途径〔32〕。

3.2预后Padin-Iruegas等〔33〕从伴转移的结肠癌病人的血样本中分离循环癌干细胞，发现不同干细胞标志物CD133,SOX2,OCT4 和TWIST1表达水平在治疗过程的不同阶段有显著的不同。评估这些干细胞基因的表达对预测治疗过程的疗效是有用的，而样本相对容易获得使这种方法简便易行。Gerger等〔34〕通过DNA测序或聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)观察了234例以5-氟尿嘧啶(FU)为基础的化疗病人血液标本中CCSCs基因的种系多态性，预测三期和高风险二期结肠癌病人的肿瘤复发时间,发现CD44 rs8193 C>T,ALCAM rs1157 G>A,LGR5 rs17109924 T>C 的小等位基因与肿瘤复发时间增加显著相关,明确了CCSCs基因的常见种系变体可作为结肠癌病人3期和高风险2期的独立预后标志物。Hu等〔35〕还发现伴糖尿病的结肠癌病人中晚期糖基化终产物受体(RAGE)及上游信号通路在维持CCSCs特性及致瘤性中具有重要作用，这项研究不但将结肠癌和糖尿病并发症的发生联系起来，而且也提供了肿瘤发生危险性评估和生物药物治疗的一种新途径。

4参考文献

1Schwitalla S,Fingerle AA,Cammareri P,etal.Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties〔J〕.Cell,2013;152(1-2):25-38.

2Yang G,Quan Y,Wang W,etal.Dynamic equilibrium between cancer stem cells and non-stem cancer cells in human SW620 and MCF-7 cancer cell populations〔J〕.Br J Cancer,2012;106(9):1512-9.

3Zou J,Yu XF,Bao ZJ,etal.Proteome of human colon cancer stem cells:a comparative analysis〔J〕.World J Gastroenterol,2011;17(10):1276-85.

4Duan X,Li H,Chen H,etal.Discrimination of colon cancer stem cells using noncanonical amino acid〔J〕.Chem Commun(Camb),2012;48(72):9035-7.

5Ke J,Wu X,Wu X,etal.A subpopulation of CD24+cells in colon cancer cell lines possess stem cell characteristics〔J〕.Neoplasma,2012;59(3):282-8.

6Leng Z,Tao K,Xia Q,etal.Kruppel-like factor 4 acts as an oncogene in colon cancer stem cell-enriched spheroid cells〔J〕.PLoS One,2013;8(2):e56082.

7Amsterdam A,Raanan C,Schreiber L,etal.Use of multiple biomarkers for the localization and characterization of colon cancer stem cells by indirect immunocytochemistry〔J〕.Int J Oncol,2012;41(1):285-91.

8Kobayashi S,Yamada-Okabe H,Suzuki M,etal.LGR5-positive colon cancer stem cells interconvert with drug-resistant LGR5-negative cells and are capable of tumor reconstitution〔J〕.Stem Cells,2012;30(12):2631-44.

9Sakthianandeswaren A,Christie M,D′Andreti C,etal.PHLDA1 expression marks the putative epithelial stem cells and contributes to intestinal tumorigenesis〔J〕.Cancer Res,2011;71(10):3709-19.

10Hart LS,Dolloff NG,Dicker DT,etal.Human colon cancer stem cells are enriched by insulin-like growth factor-1 and are sensitive to figitumumab〔J〕.Cell Cycle,2011;10(14):2331-8.

11Lin L,Liu Y,Li H,etal.Targeting colon cancer stem cells using a new curcumin analogue,GO-Y030〔J〕.Br J Cancer,2011;105(2):212-20.

12Lin JT,Wang JY,Chen MK,etal.Colon cancer mesenchymal stem cells modulate the tumorigenicity of colon cancer through interleukin 6〔J〕.Exp Cell Res,2013;319(14):2216-29.

13Liu Y,Han ZP,Zhang SS,etal.Effects of inflammatory factors on mesenchymal stem cells and their role in the promotion of tumor angiogenesis in colon cancer〔J〕.J Biol Chem,2011;286(28):25007-15.

14Zhou D,Zhang Y,Wu H,etal.Mst1 and Mst2 protein kinases restrain intestinal stem cell proliferation and colonic tumorigenesis by inhibition of Yes-associated protein(Yap)overabundance〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2011;108(49):E1312-20.

15Feng Y,Dai X,Li X,etal.EGF signalling pathway regulates colon cancer stem cell proliferation and apoptosis〔J〕.Cell Prolif,2012;45(5):413-9.

16Shenoy AK,Fisher RC,Butterworth EA,etal.Transition from colitis to cancer:high Wnt activity sustains the tumor-initiating potential of colon cancer stem cell precursors〔J〕.Cancer Res,2012;72(19):5091-100.

17Múnera J,Cecea G,Jedlicka P,etal.Ets2 regulates colonic stem cells and sensitivity to tumorigenesis〔J〕.Stem Cells,2011;29(3):430-9.

18Haffner MC,Chaux A,Meeker AK,etal.Global 5-hydroxymethylcytosine content is significantly reduced in tissue stem/progenitor cell compartments and in human cancers〔J〕.Oncotarget,2011;2(8):627-37.

19Lombardo Y,Scopelliti A,Cammareri P,etal.Bone morphogenetic protein 4 induces differentiation of colorectal cancer stem cells and increases their response to chemotherapy in mice〔J〕.Gastroenterology,2011;140(1):297-309.

20Merlos-Suárez A,Barriga FM,Jung P,etal.The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse〔J〕.Cell Stem Cell,2011;8(5):511-24.

21Dieter SM,Ball CR,Hoffmann CM,etal.Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases〔J〕.Cell Stem Cell,2011;9(4):357-65.

22Belton A,Gabrovsky A,Bae YK,etal.HMGA1 induces intestinal polyposis in transgenic mice and drives tumor progression and stem cell properties in colon cancer cells〔J〕.PLoS One,2012;7(1):e30034.

23Zubeldia IG,Bleau AM,Redrado M,etal.Epithelial to mesenchymal transition and cancer stem cell phenotypes leading to liver metastasis are abrogated by the novel TGFβ1-targeting peptides P17 and P144〔J〕.Exp Cell Res,2013;319(3):12-22.

24Hogan NM,Joyce MR,Murphy JM,etal.Impact of mesenchymal stem cell secreted PAI-1 on colon cancer cell migration and proliferation〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2013;435(4):574-9.

25Zhang H,Li W,Nan F,etal.MicroRNA expression profile of colon cancer stem-like cells in HT29 adenocarcinoma cell line〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2011;404(1):273-8.

26Fang Y,Xiang J,Chen Z,etal.miRNA expression profile of colon cancer stem cells compared to non-stem cells using the SW1116 cell line〔J〕.Oncol Rep,2012;28(6):2115-24.

27Chen J,Chen Y,Chen Z.MiR-125a/b regulates the activation of cancer stem cells in paclitaxel-resistant colon cancer〔J〕.Cancer Invest,2013;31(1):17-23.

28Wu S,Wang X,Chen J,etal.Autophagy of cancer stem cells is involved with chemoresistance of colon cancer cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2013;434(4):898-903.

29O′Brien CA,Kreso A,Ryan P,etal.ID1 and ID3 regulate the self-renewal capacity of human colon cancer-initiating cells through p21〔J〕.Cancer Cell,2012;21(6):777-92.

30van Houdt WJ,Emmink BL,Pham TV,etal.Comparative proteomics of colon cancer stem cells and differentiated tumor cells identifies BIRC6 as a potential therapeutic target〔J〕.Mol Cell Poteomics,2011;10(12):M111.011353.

31Bitarte N,Bandres E,Boni V,etal.MicroRNA-451 is involved in the self-renewal,tumorigenicity,and chemoresistance of colorectal cancer stem cells〔J〕.Stem Cells,2011;29(11):1661-71.

32Inoda S,Hirohashi Y,Torigoe T,etal.Cytotoxic T lymphocytes efficiently recognize human colon cancer stem-like cells〔J〕.Am J Pathol,2011;178(4):1805-13.

33Padin-Iruegas ME,Herranz-Carnero M,Aguin-Losada S,etal.Prognostic value of changes in the expression of stem cell markers in the peripheral blood of patients with colon cancer〔J〕.Oncol Rep,2013;29(6):2467-72.

34Gerger A,Zhang W,Yang D,etal.Common cancer stem cell gene variants predict colon cancer recurrence〔J〕.Clin Cancer Res,2011;17(21):6934-43.

35Hu X,Cheng Y.Possible participation of receptor for advanced glycation end products(RAGE)in the origin of cancer stem cells in diabetic patients with colon cancer〔J〕.Med Hypotheses,2013;80(5):620-3.

〔2015-04-09修回〕

(编辑王一涵)

基金项目：安徽省自然科学研究重点项目(KJ2014A147)

通讯作者：孙国平(1961-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事肿瘤药理及个体化治疗研究。

〔中图分类号〕R735.3

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2790-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.107

1北京大学人民医院消化科

2安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科

第一作者：陈方军(1973-)，男，在读博士，副教授，主要从事肿瘤药理及个体化治疗研究。