黄芩苷防治脑缺血作用机制

王龙梓

(山东淄博职业学院，山东　淄博　255314)

黄芩苷防治脑缺血作用机制

王龙梓

(山东淄博职业学院，山东淄博255314)

〔关键词〕黄芩苷；黄芩素；脑缺血；抗氧化；炎症反应；信号通路

缺血性脑血管病主要病理生理表现为脑缺血和再灌注损伤，氧化损伤、炎症反应、钙离子超载、血脑屏障损害、细胞凋亡等均是脑缺血损伤的重要病理生理机制。黄芩苷(BA)具有脑缺血保护作用。黄酮类化合物BA为常用中药黄芩的主要活性成分，也是中药清开灵注射液中的主要活性成分。BA属葡萄糖醛酸苷类，水解后产生黄芩素(BAE)和葡萄糖醛酸。BA具有抑菌、抗病毒、抗癌、抗感染、抗氧化等作用〔1，2〕。且BA可透过血脑屏障分布于脑组织〔3〕。大鼠行大脑中动脉阻断(MCAO)导致脑缺血后，BA在脑组织中的分布明显增多〔4〕。BA可通过多种机制防治脑缺血再灌注损伤。

1BA的抗氧化作用

氧化应激在脑缺血再灌注损伤中起核心作用。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时,体内活性氧(ROS)自由基等产生过多，超出机体清除氧化物的能力，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤〔5〕。BA和BAE的神经保护作用与其抗氧化作用密切相关。

BA通过抑制过氧化物的产生，增强抗氧化酶活性保护脑缺血再灌注损伤。Cao等〔6〕应用沙鼠制备短暂性脑缺血再灌注损伤模型，腹腔注射50、100和200 mg/kg的BA。再灌注损伤7 d后检测结果显示，100和200 mg/kg BA明显减轻脑缺血再灌注损伤的病理学变化，明显增强超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、GSH过氧化物酶(GSH-PX)的活性，降低脂质过氧化物丙二醛(MDA)水平。结果提示，BA可通过增强抗氧化酶活性，降低过氧化物产生发挥脑缺血保护作用。Xu等〔7〕发现BA通过清除超氧化物和与过氧化物反应产生强大的抗氧化作用。BA在体外可通过抑制外源性和内源性过氧亚硝基阴离子诱导的神经毒性保护SH-SY5Y神经细胞系；在大鼠MCAO模型，BA抑制缺血再灌注损伤脑组织中3-硝基酪氨酸的形成，减小脑梗死体积，这与过氧亚硝基阴离子分解催化剂FeTMPyP作用相似。BA通过强大的抗氧化活性产生脑保护作用，但有其作用时间窗。Cheng等〔2〕将BA用于MCAO小鼠，可通过降低ROS的产生，抑制MDA的产生，调节还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性等产生强大的抗氧化作用。BA抑制过氧化氢(H2O2)中介的新生SD大鼠大脑皮质神经细胞损伤，改进神经细胞中的SOD活性，剂量依赖性强大的羟自由基(OH-)和二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基清除作用是重要的神经保护机制。同时制备大鼠 MCAO模型，缺血1.5 h后实现再灌注。MCAO后0，2，4和6 h注射15 mg/kg BA。发现BA 4 h以内应用能改善MCAO大鼠神经功能，减小脑梗死体积，降低细胞凋亡，而MCAO后6 h应用则无明显效果。提示BA治疗脑缺血作用有时间限制，其保护大鼠脑缺血再灌注损伤的时间窗为MCAO后4 h内。

BAE同样通过抗氧化产生神经保护作用。Liu等〔8〕发现，在氧糖剥夺(OGD)导致缺血损伤的培养皮质神经元模型中，黄芩素通过抑制ROS的产生减轻神经元细胞损伤。但BAE脑保护作用效果可能与BA不同。研究显示，BA和BAE对可逆性大鼠脑缺血均有明显保护作用，但对于不可逆大鼠脑缺血，BA而不是BAE可明显减小脑梗死体积和抑制细胞凋亡，产生脑保护作用〔8，9〕。

清除体内产生的ROS需要抗氧化酶的参与。人体内主要的抗氧化酶有SOD、过氧化氢酶(CAT)、GSH-PX、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、醌还原氧化酶(NQOs)和血红素加氧酶(HOs)等。上述抗氧化酶有共同的启动子，叫作抗氧化元件(ARE)。核因子E2相关因子2(Nrf2)/ARE的表达可以激活处于下游的上述抗氧化酶〔10〕。Johnson等〔11〕提出激活在氧化应激细胞中的Nrf2-ARE信号通路是一种新的神经保护途径，可以抵御一系列的氧化、压力相关的神经病变。Lee等〔12〕研究发现BAE通过活化Nrf2，进而活化其中介的锰SOD(MnSOD)，抑制H2O2诱导的线粒体氧化损伤。Zhang等〔13〕发现，BAE预防性应用明显抑制6羟基多巴胺诱导的PC12细胞损伤。BAE增加Nrf2/HO-1 蛋白表达，抑制kelch样环氧氯丙烷相关蛋白(Keap)1表达，具有时间和浓度依赖性。此外，BAE诱导Nrf2核易位，促进ARE转录活化，保护6羟基多巴胺诱导的氧化损伤。BAE的这种作用可被Nrf2小干扰RNA(siRNA)转染，被HO-1抑制剂锌卟啉(Znpp)及蛋白酶体抑制剂 MG132减弱。

2BA的抗感染作用

炎症反应是脑缺血损伤的关键因素之一。涂献坤等〔14〕制备SD大鼠MCAO模型，脑缺血后2 h给予BA治疗，缺血24 h后进行指标检测。结果显示，BA治疗明显降低脑梗死体积。抗炎机制研究发现，大鼠脑缺血损伤可诱导髓过氧化物酶(MPO)的升高，BA 100 mg/kg可抑制缺血脑组织MPO的活性。提示炎症反应介导缺血性脑损伤的病理过程，BA具有抗感染作用。已知肿瘤坏死因子(TNF)-α是诱导脑缺血损伤的主要炎性细胞因子之一〔15〕，研究同时发现缺血脑组织TNF-α含量明显升高，BA 100 mg/kg和200 mg/kg可减轻缺血脑组织TNF-α的分泌，进一步说明BA可通过抑制炎症性因子TNF-α减轻炎症反应，从而减轻缺血性脑损伤。核因子(NF)-κB是与炎症反应密切相关信号传导通路的一个关键因素〔16〕。Xue等〔17〕应用雄性Wistar大鼠制备MCAO模型，50、100 和200 mg/kg的BA于缺血后静脉注射。缺血2 h再灌注24 h后检测结果显示，应用BA后，大鼠神经功能明显改善，脑梗死体积缩小，缺血脑损伤病理变化减轻，缺血再灌注大脑皮质中高表达的NF-κB p65明显降低。结果提示BA的脑保护作用与抑制NF-κB p65的表达有关。

脑缺血再灌注损伤能导致炎症反应也与具有免疫激活功能的受体相关。NOD2是一种初始免疫反应受体，与几种炎症反应相关。Li等〔18〕将BA应用于OGD神经元细胞模型和脑缺血再灌注损伤模型，发现在OGD模型中的NOD2 和TNF-α的表达在BV2细胞，PC12细胞和神经元细胞均上调，而10 μg/ml的BA明显下调NOD2、TNF-α蛋白和mRNA的表达。同样，50 μg/ml的BA也明显下调脑缺血再灌注损伤动物模型NOD2、TNF-α蛋白和mRNA的表达。结果提示NOD2可作为BA通过抗炎发挥神经保护作用的重要靶点。

Toll样受体(TLR)是炎症反应的初始因素〔19〕。TLR4是脑内重要的免疫分子。脑内TLR4被其相应配体激活后，促使前炎症因子产物释放和其后的免疫应答〔20〕。TLR2/4及其下游的NF-κB信号通路中介炎症反应，这是脑缺血损伤重要病理生理机制。Tu等〔21〕应用成年SD大鼠制备不可逆MCAO模型，在MCAO后2 h和12 h两次腹腔注射BA。MCAO后24 h检测结果显示，BA治疗明显降低MCAO后大鼠脑梗死体积，降低大鼠脑组织TLR2/4和NF-κB的表达，降低诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧酶(COX)-2的表达和活性。减少血清中TNF-α和白细胞介素(IL)-1β的含量。侯金才等〔22〕应用原代培养小胶质细胞，采用缺氧/复氧的方式制备体外缺氧再灌注实验模型，用BA 25、50、100 μmol/L 3个浓度梯度进行干预，结果显示缺氧/复氧激活TLR4通路，并通过髓样分化因子(MyD88)依赖途径激活TLR4和下游蛋白MyD88、NF-κB、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、NF-κB抑制蛋白(I-κB)和p38；BA高剂量组明显抑制了通路中TLR4、MyD88、NF-κB、ERK与p38蛋白的活性和I-κB蛋白的降解。Li等〔23〕考察了TLR2/4的体内体外表达实验，成功建立小鼠全脑缺血再灌注损伤模型和OGD初级神经元和PC12细胞损伤模型，检测结果显示，脑缺血动物模型海马组织和OGD细胞损伤模型TLR2/4和TNF-α表达均明显升高，而BA的治疗则能明显下调动物模型和细胞模型的TLR2/4和TNF-α表达。上述研究表明，BA能抑制脑缺血后TLR2/4信号通路，抑制神经损伤后炎症反应，TLR可能是BA的治疗靶点。

3BA修复血脑屏障，抑制脑水肿

水通道蛋白(AQP)是新近发现的一组与水跨膜转运有关的蛋白质，AQP4在脑组织中表达最丰富,它是一种双向水转运通道蛋白,与脑水肿的发生发展关系密切。且AQP-4在血脑屏障破坏中起着重要的作用〔24〕。BA可抑制缺血性脑损伤大鼠脑组织AQP-4的表达，修复损伤的血脑屏障，抑制脑水肿，保护大鼠缺血性脑损伤〔14〕。Zhu等〔25〕应用培养小鼠微血管内皮细胞建立体外血脑屏障模型，在此基础上通过OGD建立体外缺血模型。发现OGD导致体外血脑屏障模型不稳定性明显增加。BA有效改善血脑屏障模型不稳定性，促进紧密连接蛋白(TJ)：闭合蛋白-5和胞质紧密连接蛋白-1的转录和表达。结果提示BA可恢复缺血条件下的血脑屏障功能，这与其促进TJ蛋白的表达有关。

局灶性脑缺血损伤导致基质金属蛋白酶(MMP)-9表达的增加，诱导血管源性的脑水肿，破坏血脑屏障的完整性。Tu等〔26〕应用SD大鼠制备不可逆MCAO模型，在MCAO后2 h和12 h腹腔注射BA。MCAO后24 h检测结果显示，BA治疗明显降低MMP-9蛋白和 mRNA的表达。在MCAO后被抑制的紧密连接蛋白occludin的表达，在BA治疗后表达上调。BA的上述作用机制使脑水肿和血脑屏障不完整性得到明显抑制。

4BA抑制细胞凋亡，促进神经发生

研究显示，BA用于脑缺血动物模型，在明显改善实验动物认知和记忆能力，减小脑梗死体积的同时，下调促凋亡基因Bax的表达，下调Bax/Bcl-2比值，降低COX-2的表达，抑制神经细胞凋亡〔27，28〕。Cao等〔6〕发现BA可通过促进脑源性神经营养因子(BDNF)的表达，抑制沙鼠缺血海马组织促凋亡蛋白半胱氨酸蛋白激酶(Caspase)-3的活性，抑制Caspase-3蛋白和mRNA的表达保护沙鼠全脑缺血再灌注损伤。由于BDNF可促进海马神经细胞再生〔29〕，因此BA对沙鼠全脑缺血的保护作用既与其抗细胞凋亡作用相关，也与其促进神经再生相关。

Li等〔30〕发现BA能诱导多能C17.2神经干细胞分化，这种作用是由活化ERK1/2中介的，提示BA可能具有促进神经再生的作用。Zhuang等〔31〕研究显示，在内源性神经干/祖细胞(NSPCs)增殖过程中，BA活化Mash1基因改变细胞分化，增加神经元细胞标记的表达。并行的动物实验结果显示，BA治疗短暂性脑缺血大鼠3 w即改进大鼠认知功能，增加海马新生细胞数量，促进脑缺血后新的神经元产生。

5BA与脑缺血损伤信号通路

许多基因、蛋白质和信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌酸-3-激酶(PI3K)/蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶(Akt)、NF-κB、Janus激酶-信号转导和转录激活子(JAK-STAT)等都与脑缺血再灌注损伤有关。有学者〔32〕提出网络药理学的概念。网络药理学认为，复杂疾病的治疗应该瞄准整个疾病网络，只有同时调节疾病网络中的多个靶点才能有效干扰疾病表型。已经发现以BA为代表的具有脑保护作用的天然化合物恰恰具有多靶点作用的特点。周才秀等〔33〕研究发现作为中药清开灵注射液中的主要活性成分BA对小鼠缺血海马组织基因表达的影响复杂，具有多样性：可影响调节转录、信号转导、蛋白氨基酸磷酸化、钙调控、细胞骨架、细胞变异、细胞增殖和神经系统发育等多方面功能基因表达。 Zhang等〔34〕考察BA对MCAO小鼠脑组织不同蛋白质表达模式的影响，发现与假手术组相比，MCAO模型组检测部位24种蛋白质发生3倍量的改变，而BA治疗MCAO组则没有明显的变化。蛋白相关基因分析显示，这24种蛋白质与15种生物学过程相关，包括细胞发生发展过程和生物调节。发现BA主要调节能量代谢相关蛋白，而调节坏死和凋亡蛋白作用相对较弱。Chen等〔32,35〕从信号通路水平和神经网络水平考察包括BA在内的多种化合物对小鼠脑缺血再灌注损伤海马组织基因表达和相应信号通路的影响。发现BA使缺血损伤小鼠梗死体积明显减小，明显影响的靶基因达181个。

分析多种信号通路的相互作用是网络药理学领域的重要挑战。为揭示缺血过程中不平衡的信号通路和药理学机制，Liu等〔36〕应用BA或BA联合栀子苷治疗MCAO小鼠。结果显示缺血活化的Wnt信号通路和NF-κB信号通路中关键蛋白的表达被BA治疗或BA联合栀子苷治疗明显改变。Dai等〔37〕制备沙鼠全脑缺血再灌注损伤模型，沙鼠全脑缺血后立即腹腔注射200 mg/kg BA，再灌注7 d后检测结果显示BA治疗明显改善神经功能，抑制缺血诱导的神经损伤，明显促进沙鼠全脑缺血后海马组织 GABA(A)R α1、GABA(A)R γ2 和KCC2 等GABA信号分子蛋白和mRNA的表达，明显增强热休克蛋白(HSP)70和磷酸化(p)-ERK的表达，显著减少磷酸化JNK(p-JNK)和磷酸化(p)-p38的表达。结果提示，BA活化全脑缺血后GABA信号通路，激活HSP70 和 MAPKs级联反应，这可能是BA神经保护作用的机制。

6BA防治脑缺血作用研究展望

天然化合物BA具有多靶点作用特点，可通过有效的抗氧化和抗炎作用，抑制脑水肿，促进神经细胞存活，调节脑缺血损伤信号传导通路等多种作用机制保护脑缺血再灌注损伤。此外，已经发现BA的治疗脑缺血再灌注损伤的作用有其时间窗〔2〕，这对指导临床天然脑保护药物的合理应用有重要意义。

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〔2014-03-19修回〕

(编辑王一涵)

〔中图分类号〕R742

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2787-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.106

第一作者：王龙梓(1976-)，男，硕士，讲师，主要从事心脑血管药理学研究。