SCF/c-Kit在缺血性脑血管病血管再生中的作用



SCF/c-Kit在缺血性脑血管病血管再生中的作用

卢桃利罗勇

(重庆医科大学附属第一医院神经内科重庆市神经病学重点实验室，重庆400016)

关键词〔〕SCF/c-Kit；血管再生；内皮祖细胞

第一作者：卢桃利(1986-)，女，硕士，住院医师，主要从事脑血管病的损伤及保护机制研究。

干细胞因子(SCF)是一种低氧诱导细胞因子，在心肌缺血、脑卒中和动脉闭塞等病理损伤后大量上调。SCF因能通过与受体c-Kit结合促进造血干细胞(HSCs)/内皮祖细胞(EPCs)生存、黏附、动员〔1〕。脑缺血后EPCs参与的血管发生在促进血管、神经再生及神经功能恢复方面发挥着主要作用。已证实脑缺血后SCF/c-Kit信号通路能促进神经干细胞(NSCs)在脑内的动员、迁移及归巢，利于脑缺血后的神经再生〔2〕。但关于SCF/c-Kit信号通路促进骨髓EPCs动员到外周血，迁移及归巢到脑内等过程尚未有文献报道。本文就SCF/c-Kit信号通路在缺血性脑血管病中的可能作用作一综述。

1SCF及其受体的生物学特点

SCF又称肥大细胞生长因子(MGF)，Kit配体(KL)及Steel因子(SLF)。它是由骨髓微环境中基质细胞产生的一种酸性糖蛋白，其糖基连在肽键的N和O基团上，相对分子质量31 000～36 000，由非共价结合的两个相同亚基组成，等电点PI=3.8〔3〕。SCF共有273个氨基酸〔4〕，从-25～-1为信号肽，+1～+189为膜外功能区，+190～+216为跨膜区，+217～+248为胞质功能区。鼠与人的SCF有83%的同源性。天然SCF有两种存在形式：可溶型SCF(sKitL)与膜结合型SCF(mKitL)。sKitL由可溶型SCF蛋白编码248个氨基酸，有跨膜区，在第6外显子中有一蛋白酶切割位点，经蛋白酶水解去掉跨膜区，最终产物为N末端165氨基酸，仍为可溶型，并具有SCF活性；mKitL由膜结合型SCF蛋白编码220个氨基酸，有跨膜区，mRNA在拼接过程中去除第6个外显子(149～177氨基酸)，从而缺少蛋白酶切割位点，保留跨膜区〔5〕。总之，SCF的两种形式为同一编码mRNA在不同位点剪切所致，故SCF为两种不同mRNA转录产物，在动员EPCs的过程中起主要作用的是sKitL〔6〕。

SCF配体是原癌基因c-Kit编码蛋白，分子量为145 kD，也被称为CD117。人类c-Kit原癌基因定位于4号染色体q31～34区。编码一个由976个氨基酸残基组成的跨膜蛋白：胞外区497个，跨膜区23个，胞内区433个。其中胞外区包含5个免疫球蛋白区(1～9号外显子)，第2和第3个免疫球蛋白区是与SCF结合的关键部位，第4及第5个免疫球蛋白区是形成二聚化必不可少的区域，含有5个k样结构，且具有酪氨酸激酶活性，能够在SCF、血小板衍生因子(PDGF)或集落刺激因子(CSF)-1的作用下产生相应的信号转导〔7〕。1%～4%正常人的骨髓干细胞表面可表达c-Kit受体，且在人CD34+造血细胞中大约60%～75%的细胞表面表达c-Kit受体，其具体表达情况随造血干/祖细胞的发育成熟呈现一定变化趋势，原始造血细胞表面c-Kit较少，祖细胞水平时达到高峰，随着祖细胞向成熟血细胞分化而逐渐降低，到终末分化血细胞表面不再有c-Kit的表达〔8〕。SCF与c-Kit之间的特异性结合可触发c-Kit的同源二聚体化和细胞膜内酪氨酸残基磷酸化，产生停泊位点，捕获含有SH2结构域的信号分子、还能直接激活蛋白激酶C、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Ras相关的C3肉毒素底物(Rac1)、c-Ju-氨基末端激酶(JNK)、Raf-1蛋白激酶、Janus激酶(JAK)2等，通过多种信号因子的参与将细胞外的信号转导到细胞内部，引发某些基因的特异性表达〔9〕。研究表明：SCF/c-Kit下游信号转录情况是非常复杂的，它是各种底物激酶酪氨酸磷酸化和丝/苏氨酸激酶磷酸化的共同参与和整合，且存在许多信号转导途径之间的串话作用(cross-talking)，从而精确地调控细胞分化、增殖、生存、黏附和迁移〔10〕，其具体机制是近年来信号转导研究中的热点问题。

2与SCF/c-Kit 相关的信号通路

2.1磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)通路SCF通过与受体c-Kit结合直接激活PI3K/Akt通路。当SCF与c-Kit结合时，c-Kit受体酪氨酸激酶磷酸化，在激酶插入区第719位酪氨酸处与PI3K的p85亚基结合，使之磷酸化，激活p110催化亚基〔7〕。研究发现，当c-Kit第719位酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)时，既失去与PI3K p85亚基耦联的能力，又丧失由SCF介导使PI3K活性增加的能力，但Y719F c-Kit自动磷酸化活性没有损伤〔11〕。激活的蛋白激酶B(PKB)又能激活下游的信号分子p70核糖体S6激酶(p70S6K)、PKB(即Akt)和NF-κB〔12〕。

2.2Ras蛋白/丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)通路SCF与c-Kit结合激活Ras蛋白，诱导增殖反应。SCF介导c-Kit的磷酸化，c-Kit 受体激活后，酪氨酸残基703及936则通过Grb2的衔接及蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP2、ShcA 间接或直接与Sos蛋白相作用，Ras直接与后者相关联，激活Ras蛋白〔13〕。激活的Ras蛋白能继续激活Raf-1(丝氨酸/苏氨酸)激酶，并最终激活MAPK及细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)。二者随后磷酸化一系列的转录因子，影响基因转录，调控HSCs分化〔14〕。完整Src家族激酶(SFK)结合位点的存在是此通路激活不可或缺的条件〔15〕。

2.3Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)通路SCF参与诱导JAK/STAT通路的激活。SCF可以诱导JAK2与c-Kit耦联，激活JAK2，使下游的STAT1a、STAT3、STAT5A、STAT5b磷酸化，诱导细胞增殖反应〔16〕。STAT除通过JAK激活外，还可被c-Kit受体直接激活。当SCF作用于表面表达有c-Kit受体的骨髓细胞和成纤维细胞时，c-Kit胞内的不同结构域可诱导STAT1a、STAT3、STAT5A、STAT5b与之发生耦联磷酸化〔17〕。SCF诱导的JAK/STAT 通路的活化与胚胎肝脏造血祖细胞的增殖和分化有关。

2.4Src 通路目前发现的酪氨酸蛋白激酶Scr家族的成员有：Src、Yes、Fyn、Lck、Lyn、Blk、Hck〔18,19〕。SCF诱导激活的Scr家族成员有Scr、Yes、Lyn、Fyn。Scr主要通过SH2结构域与激活的c-Kit近膜区的Y568、Y570磷酸化的酪氨酸特异性耦联并磷酸化〔20〕。用反义寡核苷酸降低Lyn的表达能抑制SCF诱导的细胞增殖。这与Lyn缺失的肥大细胞，SCF诱导的细胞增殖被削弱是一致的〔19〕。研究还发现Src家族与SCF诱导的c-Kit的运输有关，但具体机制还不清楚。

2.5磷酯酶C(Plc)-y通路Plc-y主要水解磷脂酰肌醇4，5二磷酸(PIP2)生成二酰甘油和1,4,5-三磷酸肌醇，调节细胞内钙水平，发挥生物学效应。研究证实Plc-y的激活与mSCF有关，sSCF不能诱导Plc-y的磷酸化。而Plc-y主要与c-Kit酪氨酸残基730和936作用，进一步激活下游信号分子，在抗细胞凋亡方面发挥重要作用〔21〕。

3SCF/c-Kit 与EPCs的关系

3.1c-Kit是EPCs早期标志物之一目前把同时表达CD34+、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)2+、CD133+的细胞称为早期EPCs。有报道称c-Kit(CD117)也可表达于早期EPCs，随着EPCs向成熟内皮细胞(ECs)分化，c-Kit逐渐消失，出现血管性假血友病因子(vWF)和VE-cadhern等成熟ECs标志物〔22,23〕。c-Kit的这一特性和CD133类似。但是否CD117也能像CD133一样在识别EPCs方面有相对CD34、VEGFR2高的特异性，需待进一步的证实。

3.2SCF/c-Kit参与EPCs的动员目前的观点认为SCF/c-Kit调节EPCs的动员受基质金属蛋白酶(MMP)-9的调控。MMP-9是骨髓EPCs动员的关键因素。Heissig等〔24,25〕证实MMP-9能把KitL从mKitL转化为sKitL，EPCs可借助mKitL 结合于骨髓基质细胞上。当mKitL 转变为sKitL 时，EPCs 与基质细胞的结合减弱，同时sKitL 可以促进EPCs 的运动，使EPCs 从骨髓动员到外周血，启动EPCs动员的第一步。研究还证实MMP-9-/-小鼠的sKitL释放减少，干细胞动员受抑制。Huang等〔26〕通过研究后肢缺血小鼠也证实MMP-9-/-小鼠缺血诱导的血管新生降低，这可能是由于sKitL释放的减少，削弱了EPCs的动员、迁移及血管新生功能。Fazel等〔27〕也证实心肌缺血性损伤后，c-Kit的活化和sKitL的释放是EPCs动员的关键，而c-Kit的激活和sKitL的释放需要内源性MMP-9，c-Kit缺失的小鼠心肌梗死(MI)后易发展为心衰。Dentelli等〔28〕通过体内外研究表明，炎症能诱导ECs表达mKitL，EPCs的归巢依赖于c-Kit/mKitL的结合。敲除内源性c-Kit或者用c-Kit抑制剂能阻止EPCs的黏附。

3.3SCF/c-Kit参与EPCs的迁移EPCs的迁移受SCF/c-Kit的调节。阎昕等〔29〕通过体外培养实验证实SCF可诱导EPCs的迁移，对EPCs具有趋化作用，诱导血管生成。该实验把用流式细胞仪筛选出来的EPCs直接种植在transwell小室的上室，且把下室分为空白对照组、SCF组、血管内皮细胞生长因子(VEGF)组、Anti-SCF抗体组、免疫球蛋白G(IgG)组，12 h后分析数据为：SCF和VEGF组跨膜迁移的细胞数目为(118±6.5)个和(161±7.9)个，显著高于空白对照组(47±4.7)个，说明此两组促进细胞迁移的作用均显著；IgG组细胞数为(43±6.3)个与空白对照组比较无统计学意义；Anti-SCF组跨膜迁移细胞数目最低约(33±4.0)个。Kuang等〔30〕也报道SCF/c-Kit信号通路参与心脏干细胞(CSCs)的迁移过程。大鼠MI后5天SCF mRNA、蛋白质的表达在梗死周围向梗死中心增加有显著意义。给予c-Kit受体能抑制SCF诱导CSCs的迁移。Sun等〔31〕报道SCF/c-Kit通路可能介导NSCs向脑损伤区迁移，NSCs具有向神经元分化的潜能，进而促进神经再生。

3.4SCF/c-Kit促进血管发生血管发生是指原始血管网的形成，通过血管母细胞分化为内皮细胞形成迷宫样的血管网络，主要涉及EPCs的参与。研究证实，SCF能刺激HSCs的增殖分化，动员HSCs/EPCs到外周血，促进血管发生〔32,33〕。Matsumoto等〔34〕报道抑制Lnk蛋白(SCF/c-Kit通路的抑制蛋白)能促进SCF/c-Kit信号通路诱导的HSCs/EPCs的动员，促进骨折周围血管发生，利于骨折愈合。在炎症反应中，SCF/c-Kit同样可以通过诱导EPCs到外周血，促进病理性血管发生〔28〕。Abu EI-Asrar等〔35〕通过对8例糖尿病视网膜病(PDR)和12例非PDR病人视网膜ECs的c-Kit蛋白质表达研究发现，PDR组较非PDR组均增加，得出SCF/c-Kit对EPCs的动员、募集有促进作用，有利于PDR后的血管发生。Kim等〔36〕通过离体和在体实验证明SCF/c-Kit信号通路能直接促进EPCs介导的血管发生，得出SCF的上调能促进EPCs的动员，EPCs归巢到缺血区，直接促进EPCs介导的血管发生。

4SCF/c-Kit在缺血性脑血管病中的作用

SCF是一种多功能细胞生长因子，在神经系统中有广泛的表达，对神经系统有重要作用，通过与VEGF、脑源性神经营养因子、神经营养素等共同作用，作为NSCs的存活因子刺激NSCs增殖，在细胞增殖、分化和迁移过程中发挥重要调控作用。Jin等〔2〕证实，脑缺血缺氧后能诱导神经再生，这一过程需要营养因子SCF的参与。体外实验表明缺氧导致小鼠皮质培养细胞神经再生，这种作用是通过分泌SCF而实现的，SCF可刺激培养细胞和整体动物皮质侧脑室外侧壁的室下带(SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(SGZ)的神经再生；在体实验证实给予SCF后Brdu标记的非成熟神经元增加。Kawada等〔37〕也报道SCF能促进脑缺血后神经再生，利于功能恢复。Erlandsson等〔38〕证实SCF对NSCs的迁移和存活具有重要作用，SCF可诱导NSCs的迁移。脑卒中后给予粒细胞集落刺激因子(G-CSF)/SCF能使梗死面积降低50%，梗死周围的血管密度较对照组增加1.5倍，因而得出G-CSF/SCF可能通过诱导骨髓源性的血管发生，利于脑缺血后的功能恢复〔39〕。Zhao等〔40,41〕分别在脑卒中的急性期和慢性期给予造血因子G-CSF/SCF，发现G-CSF/SCF能降低梗死面积，神经缺失症状得到改善，利于脑的恢复。

5展望

已证实eNOS-NO-MMP-9-KitL瀑布链在骨髓EPCs的动员、迁移方面发挥着重要作用。当组织缺血、缺氧等损伤后，可释放一系列信号因子，如VEGF、基质细胞衍生因子(SDF)-1a、胎血生长因子(PLGF)等，它们被骨髓间充质干细胞(BMSCs)识别后，与其相应受体结合，通过PI3K/AKt通路激活内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，eNOS能诱导产生NO，激活MMP-9，使mKitL水解成sKitL，再与其受体c-Kit结合，诱导骨髓EPCs从“骨髓龛”动员到外周血。这只是动员骨髓EPCs的第一步，其中的具体机制需进一步研究。以往的实验也得出：①脑缺血可促进脑内SDF-1a表达的上调，SDF-1a可能通过与其受体CXCR4结合诱导EPCs向脑内迁移〔42〕；②脑缺血后脑内PLGF、PI3K/AKt的表达也增加，而PLGF的上调能进一步促进SDF-1a /CXCR4表达的增加，进而激活PI3K/Akt信号通路，促进骨髓EPCs释放入血并归巢到脑缺血区〔43～46〕；③脑缺血后脑内eNOS、MMP-9、SCF/c-Kit的表达也上调，它们作为PI3K/Akt信号转导通路的下游信号分子共同参与脑缺血后EPCs的动员、迁移、归巢〔47～49〕；④脑缺血后脑内CD34、AC133表达上调，CD34、AC133是目前公认的EPCs标志物，通过流式检测出脑缺血后外周血中EPCs的数量增加〔42,43,50〕。脑缺血确实能动员骨髓EPCs入外周血，并最终迁移入脑组织，但因涉及多种细胞因子及信号通路的参与具体机制仍不十分明确。

SCF是一种多功能细胞因子，通过与受体c-Kit的结合即能作为PI3K/Akt的下游信号分子参与EPCs的动员，也能作为一种促血管生长因子，通过激活多种信号通路诱导EPCs的动员、迁移、归巢。目前在糖尿病、缺血性心肌病、炎症、动脉闭塞等方面均证实c-Kit可通过与SCF结合动员EPCs，促进EPCs向外周迁移，利于血管发生。在缺血性脑血管病中证实SCF/c-Kit信号通路参与脑缺血后NSCs的动员、迁移、归巢，有利于脑缺血后的神经再生。但是关于SCF/c-Kit信号通路促进骨髓EPCs向脑内迁移目前国内外报道较少。因而脑缺血后对SCF/c-Kit信号通路的研究将会为骨髓EPCs的动员、迁移、归巢及EPCs参与的促进脑内血管再生进一步提供可靠依据。

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〔2014-06-19修回〕

(编辑冯超/王一涵)

通讯作者：罗勇(1965-)，男，博士，研究员，博士生导师，主要从事脑血管病的损伤及保护机制研究。

基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研 资助课题(No.20095503110001)；重庆市卫生局中医药科研项目(渝中医2005-B-24)；重庆市卫生局中医药科研重点资助项目(ZY20131027)

中图分类号〔〕R743〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0229-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.105