针刺对大鼠心肌组织细胞因子的影响

治丁铭　刘　岩　赵鸿飞　李　凡　张　朕　张　卓

(长春中医药大学，吉林　长春　130117)



针刺对大鼠心肌组织细胞因子的影响

治丁铭刘岩赵鸿飞1李凡2张朕张卓3

(长春中医药大学，吉林长春130117)

摘要〔〕目的探讨针刺肾俞、心俞、内关穴治疗慢性心力衰竭(CHF)的机制。方法将30只雄性Wistar大鼠分为对照组、卡托普利治疗组(25 mg/kg,1次/d)、针刺治疗组(针刺肾俞、心俞、内关穴，30 min/d)。复制CHF模型，2 w后，取大鼠心脏左室组织，采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、SP法检测大鼠心肌TNF-α、免疫组化SABC法检测大鼠心肌白细胞介素(IL)-6表达水平，同时观察大鼠心肌组织形态学改变。结果卡托普利治疗组、针刺组心肌中TNF-α、IL-6水平低于对照组(P<0.05或P<0.01)；卡托普利治疗组和针刺组TNF-α、IL-6水平无统计学意义(P>0.05)。结论针刺和卡托普利治疗均可通过降低炎症细胞因子改善心室重塑，而针刺治疗与卡托普利治疗效果无显著差异，可一定程度替代或作为西药治疗的有益补充，神经体液调节可能是其发挥治疗作用的机制。

关键词〔〕针刺；慢性心力衰竭；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-6

1吉林省中医药管理局2吉林省人民医院骨科

3柳河县卫生和计划生育局

第一作者：治丁铭(1983-)，女，硕士，讲师，主要从事心血管疾病文献与临证治疗研究。

各种病因引起的心肌细胞损伤将会导致心室重塑。持续不断的心室重塑最终发展至心力衰竭〔1〕。Blankesteijn等〔2〕研究发现急性心肌梗死12 h出现免疫炎症反应，其在心力衰竭的发生中发挥重要作用。有研究证实，针刺俞穴可减少心肌缺血再灌注的损伤，对免疫系统和心血管系统有良好的调节作用〔3〕。本实验从免疫和炎症的角度，对试验动物心肌组织肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6水平进行监测，初步探讨针刺对慢性心力衰竭(CHF)大鼠治疗的机制。

1材料

1.1动物健康SPF级，Wistar雄性大鼠30只，体质量200～250 g，由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供。

1.2试剂和药物大鼠(IL)-6免疫组化试剂盒购于上海彩佑实业有限公司；大鼠TNF-α酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒购于上海岚派生物科技有限公司；SABC免疫组化试剂盒(博士德公司，武汉)；羊抗大鼠TNF-α多抗(R&D，美国)；卡托普利(12.5 mg，批号：H31022986)，由中美上海施贵宝制药有限公司生产；小动物呼吸机RWD407(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；OLYMPUS生物显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.3方法

1.3.1CHF模型复制30只雄性Wistar大鼠，随机分为3组，每组10只1笼，标记后饲养在恒温、恒湿的饲养室内，标准饲料和纯净水供其随机取食。大鼠适应性喂养1 w后进行模型复制。心衰大鼠模型采用冠状动脉结扎法。首先将Wistar大鼠腹腔麻醉，背部固定，行气管插管，以小动物呼吸机行正压呼吸，在胸部4～5肋间开胸，暴露心脏，在距主动脉根部5 mm处(肺动脉圆锥和左心耳)之间结扎冠状动脉左前降支，建立心衰模型，结扎后心室壁颜色变暗,心电图检查显示ST段抬高伴肢体导联R波高尖,即为结扎成功。建模成功后，腹腔注射青霉素40万U/只以预防感染。用心导管和超声心动图确认CHF模型复制成功后开始治疗。

1.3.2治疗方法

1.3.2.1针刺依据华氏等研制的大鼠穴位图谱作为大鼠穴位选择的标准，选取大鼠内关穴、心俞穴、肾俞穴进行针刺，针刺采用30号1寸毫针，手法采用捻转泻法，捻转幅度为3～4圈，捻转频率为3～4个/s往复，每次行针10～15，留针20～30 min，留针期间行针2～4次，每天治疗1次。

1.3.2.2给药卡托普利按体质量折算(25 mg/kg)灌胃给药，每天灌服1次，连续治疗2 w。对照组只复制模型，不进行治疗。

1.3.3动物处理治疗2 w后将Wistar大鼠称重，然后用1%戊巴比妥钠按30 mg/kg的剂量腹腔注射进行麻醉，麻醉后迅速摘取大鼠心脏组织并分别进行标本处理。

1.3.4TNF-α检测血液TNF-α：抽取大鼠下腔静脉血3 ml，3 000 r/min离心10 min，分离上清液。用ELISA法来测定大鼠血清TNF-α的浓度。心肌组织TNF-α：采用羊抗大鼠TNF-α多抗，采用SP法进行检测，棕色和黄色颗粒代表阳性反应部位。

1.3.5IL-6检测采用免疫组化SABC 法(按说明书操作)后用BH-2型OLYMPUS生物显微镜(日本OLYMPUS公司)观察,并使用BI-2000微循环和医学图像分析系统进行测量。在400倍显微镜下,每组观察10张切片,每张切片随机选取10个不连续的视野计算出单位视野中的IL-6免疫阳性细胞个数(即数密度)及免疫阳性细胞所占单位视野中的阳性反应总面积(即面密度)。

1.4统计学方法采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析和t检验。

2结果

2.1三组TNF-α水平比较与对照组〔(38.20±2.11)ng/ml〕相比，针刺组、卡托普利组血清TNF-α〔(34.37±2.75)ng/ml，(35.07±2.59)ng/ml〕显著下降(P<0.05或P<0.01)。心肌组织免疫组化染色显示，对照组TNF-α蛋白呈阳性染色，针刺组和卡托普利组蛋白染色较对照组弱。

2.2三组IL-6水平比较显微镜观察结果显示,三组大鼠的心肌细胞中均可见IL-6免疫阳性细胞的存在,心肌细胞胞质中都含有特异性的棕黄色阳性反应颗粒。组间数密度比较，对照组(4.68±0.23)高于针刺组和卡托普利组〔(4.12±0.32)，(4.26±0.37)〕(P<0.05或P<0.01)，而针刺组和卡托普利组无显著差异(P>0.05)；组间面密度比较,对照组(10.41±0.62)高于卡托普利组(9.35±0.28)和针刺组(9.10±0.61)(P<0.01),而针刺组和卡托普利组之间差异不显著。

2.3心肌显微结构改变光镜下见对照组心肌细胞排列紊乱，局灶性坏死，纤维化，间质增生，瘢痕形成，残余部分心肌细胞肥大。针刺组及卡托普利组大鼠心肌组织改变情况较对照组有不同程度的改善。

3讨论

心力衰竭是临床常见的病理状态，为多心血管病的末期表现之一，可分为急性或CHF，左心、右心或全心衰竭。近年来，国内外的学者开始关注细胞因子在CHF发病中的作用，越来越多的临床和基础试验表明，细胞因子在CHF发病中发挥着重要的作用。TNF-α是由激活的巨噬细胞分泌的炎性因子，具有多种生物学效应，心力衰竭时血清TNF-α可见升高。Levine等〔4,5〕先后发现轻中度心力衰竭患者TNF-α即开始升高，恶病质患者血中TNF-α水平可见升高，且TNF-α升高与心功能分级和死亡率呈正相关。Kitaoka 等〔6〕观察发现心力衰竭患者的TNF-α等血清表达水平与心力衰竭程度呈正相关，Yokoyama等〔7〕发现，TNF-α能加速心肌细胞蛋白质的合成，并能减慢心肌细胞蛋白质分解，使肌动蛋白合成数量，同时TNF-α还能改变细胞外基质，导致心肌肥厚。

IL-6是主要血管内皮细胞和单核巨噬细胞生成的主要炎症反应性介质，可参与、可介导许多疾病的发生和发展。Feldman等〔8〕研究发现，IL-6和功能不全、心肌肥厚、肺水肿等心力衰竭的临床症状有关。Bryant等〔9〕研究发现，IL-6能刺激心肌成纤维细胞快速增生,促进心肌蛋白质加速分解,诱导心肌细胞凋亡而损害心功能。TNF-α、IL-6可长期影响心肌重塑，参与CHF的病理生理过程。通过治疗TNF-α、IL-6等细胞因子的变化可推测治疗方法可能的作用机制。

本研究提示心力衰竭时心脏本身是合成释放TNF-α和IL-6 的重要来源之一。心脏合成释放TNF-α和IL-6再反过来作用于心脏，再次引发或加重心力衰竭。这也说明，炎症因子在CHF发生发展中发挥着重要的作用。

在中医上，CHF属于“胸痹”、“心痛”、“心悸”等范畴。心气不足、胸阳不振、血行闭阻等是常见中医学病因，针灸可调整脏腑功能，疏通经脉、振奋阳气，符合CHF治疗益心气、振心阳、通心脉的治疗原则。李子勇等〔10〕研究显示，针刺能改善CHF患者的血流动力学参数，降低氨基末端脑钠肽前体(NT-pro-BNP)水平，降低急性生理与慢性健康状况(APACHEⅡ)评分。 心俞是心的背俞穴，具有调理气血、养心安神、宁心定志之功效，为历代中医名家治心胸病症之要穴。对急性心肌缺血大鼠模型研究显示，针刺心俞可影响血流动力学参数及改善心脏活动性质，针刺心俞及配穴后可使心肌张力降低，促进心肌肥大的退缩〔10〕。内关穴是手厥阴心包经之络穴，同时是八脉交会穴之一。有宽胸理气、宁心安神、调补阴阳气血、缓急止痛、疏通经脉的功效。肾俞穴具有宣肺通气、疏调上焦之效，是肺的背俞穴。针刺肾俞穴能改善肺功能，增加肺通气量，中医上，肺与心关系密切，肺主气，心主血，那么肺与心的关系即为气血关系，所以肾俞也用于与气血关系最为相关的心血管系统疾病。

参考文献4

1王爱民,王立君.心室重塑的研究进展〔J〕.疑难病杂志，2008;7(2)：123-5.

2Blankesteijn WM,Creemers E,Lutgens E,etal.Dynamic of cardiac wound healing following myocardial infarction:observation in genetically altered mice〔J〕.Acta Physiol Scand,2001;173(1):75-82.

3吕君玲,李佰承,冷俊艳，等.针刺治疗心肌缺血研究进展与思路〔J〕.四川中医，2014;32(6)：182-5.

4Levine B,Kalman J,Mayer A,etal.Elevated circulating levels of tumor necrosis factor in severe chronic heart failure〔J〕.N Engl J Med,1990;323(4):236-41.

5Torre-Amione G,Kapadia S,Benedict C,etal.Proinflammatory cytokine levels in patients with depressed left ventricular ejection fraction:a report from the studies of left ventricular dysfunction(SOLVD)〔J〕.J Am Coll Cardiol,1996;27(5):1201-6.

6Kitaoka H，Kubo T，Okawa M. Plasma adiponectin levels and left ventricular remodeling in hypertrophic cardiomyopathy〔J〕.Int Heart J，2010;51:51.

7Yokoyama T，Nakano M，Bendnarczyk JL，etal.Tumor necrosis factor-α provokes ahypertrophic growth response in adult cardiac myocytes〔J〕.Circulation，1997;95(5):1247-52.

8Feldman AM,Combed A,Wagnet D,etal.The role of tumor necrosis factor in the pathophysiology of heart failure〔J〕.J Am Coll Cardiol,2000;35:537-44.

9Bryant D,Backer L,Richardson J,etal.Cardiac failure intransgenic mice with myocardial expression of tumor necrosis factor-α〔J〕.Circulation,1998;97:1375-81.

10李子勇，老锦雄，潘清洁.针刺对慢性心力衰竭患者血流动力学及心功能的影响〔J〕.上海针灸杂志，2012;7：480-2.

〔2015-06-24修回〕

(编辑曲莉/滕欣航)

通讯作者：张卓(1976-)，女，副教授，主要从事神经系统疾病的诊断研究。

基金项目：吉林省中医药管理局科技项目(No.2014-J11;No.2014-2C4)

中图分类号〔〕R541.4〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2016)01-0019-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.01.008