胃肠间质瘤c-Kit和PDGFRA基因突变分析

孙　浩，李　卫，孙可心



胃肠间质瘤c-Kit和PDGFRA基因突变分析

孙浩，李卫，孙可心

[摘要]目的分析胃肠间质瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)跨膜酪氨酸激酶受体c-Kit和血小板源性生长因子受体(platelet-derived growth factor, PDGFRA)基因的突变特征。方法对57例GIST石蜡标本进行DNA提取、PCR扩增和直接测序，检测c-Kit外显子9、11、13、17和PDGFRA外显子12、18突变状态。结果57例GIST标本中共检出44例(77.2%)c-Kit/PDGFRA基因杂合性突变，未检测到纯合性突变。其中，c-Kit exon9突变9例(15.8%)，c-Kit exon11突变32例(56.1%)，c-Kit exon13突变2例(3.5%)，PDGFRA 18突变1例(1.8%)，c-Kit/PDGFRA均未检测到突变的13例(22.8%)。结论中国人群c-Kit/PDGFRA突变比例高，突变类型多样，其中c-Kit外显子11比例高，进行c-Kit/PDGFRA基因分型有助于靶向药物伊马替尼的选择和剂量估计。

[关键词]胃肠间质瘤；c-kit；PDGFRA；基因突变

胃肠间质瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是胃肠道最常见的间叶来源肿瘤，依照目前的GIST诊断标准，新近流行病学研究显示发病率0.66~2.20/10万[1-3]。GIST对传统化学治疗极不敏感，化疗药物有效率不足5%，进展期中位生存率仅约18个月[4]。即使完整切除肿瘤，GIST的5年生存率也仅有35%～65%，2年内复发转移率40%～50%，首诊时多达15%~50%的患者存在转移[5]。

研究发现干细胞因子表面的跨膜酪氨酸激酶受体c-Kit和血小板源性生长因子受体(platelet-derived growth factor, PDGFRA)基因的功能活化突变是GIST发生发展的关键[6]，针对以上分子靶点的靶向药物伊马替尼和舒尼替尼先后在2001年和2006年被FDA批准用于GIST的治疗，改变了这一疾病的治疗策略。伊马替尼是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)，已发现的主要分子靶点为Kit，PDGFR A/B和bcl-abl；舒尼替尼的分子靶点较前者更为丰富，可以对Kit、PDGFRs、VEGFRs、FLT3和RET产生抑制作用。它们可作为假底物与ATP竞争性结合Kit/PDGFRs受体的酪氨酸激酶位点，阻止其自身磷酸化，特异性抑制酪氨酸激酶受体，从而抑制肿瘤细胞的增殖。国际多中心Ⅱ、Ⅲ期临床试验结果显示伊马替尼治疗复发转移/无法手术GIST，其临床受益率80%左右(PR+SD)，中位生存时间由12个月提高至58个月，因此伊马替尼治疗GIST成为分子靶向治疗实体瘤的经典[7-8]。

针对原发GIST或复发转移的GIST，明确其c-Kit和PDGFRA基因突变状态，对GIST进行精确的分子分型，筛选靶向药物适宜患者，根据基因突变类型推荐合理治疗剂量，是GIST个体化诊疗的重要环节。本研究回顾性总结了我院原发或复发转移的GIST临床资料及病理特征、c-Kit和PDGFRA基因突变类型，为实现GIST个体化治疗提供依据。

1资料与方法

1.1一般资料收集我院2008年1月—2014年6月确诊为GIST并接受基因检测的患者57例。其中，男22例，女35例；年龄29~76岁，平均年龄54.0岁。57例GIST患者中原发肿瘤占80.7%(46/57)，胃原发肿瘤23例(40.3%)，小肠原发肿瘤20例(35.1%)，结直肠原发肿瘤3例(5.3%)。肿瘤直径<5 cm13例，介于5~10 cm35例，大于10 cm9例。病理特征包括病理组织学和免疫组织化学(受体蛋白CD117、CD34、bcl-2、desmin、Ki-67，PDGFRA等表达情况)结果，并参照文献[9-10]评估GIST病理组织学亚型：梭形细胞型、上皮样细胞型和混合型细胞型。其中25例(43.9%)为梭形细胞型，4(7.0%)例为上皮细胞型，28例(49.1%)为混合细胞型。有54例CD117+(94.7%)，3例CD117-者均为CD34+。见表1。

表1　57例GIST患者的临床和病理基本特征

1.2Kit和PDGFRA基因序列分析方法按照QIAGEN(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)试剂盒操作说明提取石蜡组织肿瘤细胞基因组DNA。分光光度计检测DNA浓度和纯度，OD260/280值1.8~2.0方可进行下一步实验。Kit基因第9、11、13、17外显子及PDGFRA基因第12、18外显子PCR引物序列参照文献[11-12]，见表2。PCR反应体系为50 UL，反应条件为95℃变性5 min；94℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 25 s，循环35次，最后延伸5 min。PCR产物送到上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。其测序引物序列与PCR反应相同，测序结果采用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)软件与NCBI公开发表的基因序列(c-Kit:NC_000004.11,PDGFRA:NC_000004.10)进行比对，分析其突变位点。

表2　Kit/PDGFRA基因PCR扩增引物序列

2结果

c-Kit和PDGFRA基因序列分析在57例GIST标本中共检出44例(77.2%)c-Kit/PDGFRA基因杂合性突变，未检测到纯合性突变。其中，c-Kit exon9突变9例(15.8%)，c-Kit exon11突变32例(56.1%)，c-Kit exon13突变2例(3.5%)，c-Kit exon17未检测到突变，PDGFRA exon12未检测到突变，PDGFRA exon18突变1例(1.8%)，c-Kit/PDGFRA均未检测到突变的13例(22.8%)，见表3。

表3　肿瘤定位和c-Kit和PDGFRA基因突变类型

c-Kit外显子9的突变发生在胃有4例，小肠5例，均为编码502~503密码子丙氨酸和酪氨酸的6个核苷酸(GCCTAT)串联重复插入突变，见图1、2；c-Kit外显子11的突变发生在胃有19例，小肠11例，后腹膜1例，突变类型多样，其中点突变14例，缺失突变13例，如图3、4所示，插入突变4例，其中发生在第557~560个密码子12个核苷酸的点突变是其突变“热点”，共8例；c-Kit外显子13的突变有2例，均发生在小肠，突变类型为点突变；c-Kit外显子17的突变有1例，发生在胃，突变类型为点突变；有1例发生PDGFRA外显子18的突变，部位在小肠，为常见的D842V点突变。

图1　野生型c-Kit外显子9

图2　c-Kit外显子9的突变(GCCTAT)

图3　野生型c-Kit外显子11

图4　c-Kit外显子11的缺失突变

3讨论

GIST是消化道最常见的间叶源性肿瘤，绝大部分表达Kit基因和PDGFRA基因编码。c-Kit和PDGFRA基因位于人染色体4q12-13，属于原癌基因，它们编码的受体蛋白均属于Ⅲ型酪氨酸激酶受体家族，具有相似的蛋白结构，分为4个区：膜外配体结合区、跨膜区、胞内近膜区和酪氨酸激酶区，后者又被一段插入序列分隔为ATP结合功能区(TK1)和磷酸转移酶功能区(TK2)，ATP结合功能区是伊马替尼与ATP竞争性结合的区域[11]。

正常情况下，Kit受体没有活性，其活化需要干细胞因子(stem cell factor，SCF)的参与。在GIST细胞中，由于Kit/PDGFRA基因发生功能获得性突变，相应的受体蛋白可在缺乏配体结合的情况下，发生自发性持续活化并激活下游的PI3K/Akt、RAS/MAPK和JAK/STAT3信号通路，导致肿瘤形成[12]。伊马替尼是一种特殊的酪氨酸激酶抑制剂，经FDA批准可应用于c-Kit阳性、不能手术切除和/或转移性的恶性GISTs的治疗。其作用机理在于药物结合于Kit蛋白胞浆内酪氨酸激酶功能区的ATP结合位点，阻断磷酸基团由ATP向底物酪氨酸残基的转移，从而抑制细胞增殖并恢复细胞凋亡程序。

大部分GISTs均存在Kit基因突变，从而导致c-Kit蛋白的活化,不需要配体SCF参与就能刺激肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控[13-14]。GISTs中Kit基因突变率约为90%，且突变形式多样。其中位于11号外显子Lys550-Val560区段的变异最为常见(占70~80%)，位于9号外显子Ala502-Tyr503区段的6碱基重复突变约占5%~10%。本研究检测出44例(77.2%)c-Kit/PDGFRA基因杂合性突变，约低于目前的研究报道，可能由于某些标本含肿瘤细胞数量少及一代测序方法灵敏度相对较低等因素导致少量标本出现假阳性等情况；c-Kit exon9突变9例(15.8%)，约低于江慧等[15]的研究结果，可能是由于c-Kit exon9突变发生与部位不同所致，如在小肠的突变率高于胃，而我们选择的标本较多的来源于胃，这将影响c-Kit Exon9的突变比例。c-Kit exon11突变32例(56.1%)，与目前报道的结果接近。c-Kit exon13突变2例(3.5%)，PDGFRA exon18突变1例(1.8%)，接近目前的研究报道[15]。

检测Kit基因突变对于指导GIST患者的合理用药，具有重要的参考价值。临床研究表明[13,16-17]，GIST中Kit基因的突变情况与格列卫分子靶向治疗的疗效相关：存在11号外显子突变患者的疗效最好，存在9号外显子突变的患者疗效次之，而Kit基因为野生型时，格列卫的疗效最差。另外，对于9号外显子突变的患者，提高用药剂量可显著提高疗效。研究结果表明，对于Kit基因无突变的GIST患者，还需要检测有无PDGFRA基因是否存在激活性突变(主要位于外显子12、18)，PDGFRA外显子发生突变的GIST病例对格列卫治疗敏感。临床研究显示，伊马替尼对GIST、脑瘤和黑色素瘤同样有效[18]；PDGFRA外显子18及外显子12发生突变的多数GIST患者对伊马替尼敏感。但PDGFRA外显子18的D842V突变会导致GIST患者对伊马替尼原发耐药。因此，检测肿瘤患者PDGFRA基因突变情况可用于预测伊马替尼治疗是否有效。对于外显子突变类型差异与伊马替尼疗效的关系我们也在进一步观察当中。

本研究结果提示c-Kit/PDGFRA基因突变比例高，突变类型多样，而不同的突变类型与GIST靶向治疗的选择、伊马替尼剂量的评估、疗效及预后相关[13]。因此，检测GIST的c-Kit/PDGFRA基因突变类型，根据遗传特征对GIST患者进行个体化给药具有十分重要的意义。

[参考文献]

[1]王振华,梁小波.胃肠道间质瘤流行病学研究进展[J].国际流行病学传染病学杂志,2013,40(3):211-214.

[2]刘念,耿小平.胃肠间质瘤的临床诊疗进展[J].中华消化外科杂志,2006,5(4):291-294.

[3]宋晶宇,张学彦.胃肠间质瘤内镜治疗进展[J].临床荟萃,2015,30(5):594-596.

[4]Iqbal N. Imatinib: a breakthrough of targeted therapy in cancer[J].Chemother Res Pract, 2014，19(6)：357027-357036.

[5]潘志中,伍小军,姜武.胃肠间质瘤分子分型的实践价值[J].中华胃肠外科杂志,2014,17(4):317-320.

[6]Sendur M A, Ozdemir N Y, Akinci M B,etal. Is exon mutation analysis needed for adjuvant treatment of gastrointestinal stromal tumor[J].World J Gastroenterol, 2013,19(1):144-146.

[7]Verweij J, Casali P G, Zalcberb J,etal. Progression free survival in gastrointestinal stromal tumours with high-dose imatinib:randomized trial[J].Lancet, 2004，15(3)：364-368.

[8]李楠静,毕锋,邱萌.胃肠道间质瘤的分子靶向治疗进展[J].四川医学，2010,31(1):117-119.

[9]Pauls K， Merkelbach, Bruse S，etal. PDGFRA and c-kit mutated gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are characterized by distinctive histological and immunohistochemical features[J].Histopathology, 2005,46(2):166-175.

[10]王春萌,师英强,董锐增.伊马替尼耐药胃肠间质瘤的免疫组织化学和基因特征[J].肿瘤,2008,28(12):1064-1068.

[11]Daniels M, Lurkin I, Pauli R,etal. Spectrum of KIT/PDGFRA/BRAF mutations and Phosphatidylinositol-3-Kinase pathway gene alterations in gastrointestinal stromal tumors (GIST)[J].Cancer Lett, 2011,312(1):43-54.

[12]徐佳,曹晖.胃肠间质瘤靶向治疗耐药的分子机制及治疗策略[J].中华胃肠外科杂志,2013,16(3):288-291.

[13]Corless C L. Gastrointestinal stromal tumors: what do we know now [J].Mod Pathol, 2014,27(1):S1-16.

[14]Ma Y Y, Yu S, He X J,etal. Involvement of c-KIT mutation in the development of gastrointestinal stromal tumors through proliferation promotion and apoptosis inhibition[J].Onco Targets Ther, 2014，23(5):637-643.

[15]江慧,宋纯,张桂荣,等.41例胃肠间质瘤c-Kit及PDGFRA基因突变分析[J].肿瘤学杂志,2013,19(11):832-837.

[16]朱 峰,董都选,张颖,等.食管癌/胃癌合并胃肠道间质瘤 2 例[J].西北国防医学杂志,2013,34(6):536.

[17]Tap W D, Schwartz G K. That's the "GIST" of it: use of adjuvant imatinib after resection of a primary GI stromal tumor[J].J Clin Oncol,2014,32(15):1543-1546.

[18]Serrano C, George S. Recent advances in the treatment of gastro- intestinal stromal tumors[J].Ther Adv Med Oncol, 2014,6(3):115-127.

(收稿时间：2015-09-20修回时间：2015-10-21)

·论著·

Analysis of c-Kit and PDGFRA Gene Mutation in GIST

SUN Hao1, LI Wei1, SUN Ke-xin2(1. Department of Gastrointestinal Surgery, Chongqing Cancer Hospital Affiliated to Guangxi Medical University, Chongqing 400030, China; 2. the First Department of Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400030, China)

[Abstract]ObjectiveTo analyze mutation characteristics of transmembrane receptor tyrosine kinase c-kit and platelet-derived growth factor (PDGFRA) genes in gastrointestinal stromal tumor (GIST) patients. MethodsDNA extraction, PCR amplification and direct sequencing were performed in 57 paraffin-embedded GIST specimens in order to detect mutations of t-RTKS exon 9, 11, 13 and 17 and PDGFRA exon 12 and 18. ResultsA total of 44 cases (77.2%) of c-Kit/PDGFRA gene heterozygous mutation were detected among the 57 GIST specimens, but there was no homozygosity mutation. There were 9 cases (15.8%) of t-RTKS exon 9 mutations, 32 cases (56.1%) of t-RTKS exon 11 mutations, 2 cases (3.5%) of t-RTKS exon 13 mutations, 1 case (1.8%) of PDGFRA exon 18 mutation and 13 cases (22.8%) without t-RTKS/PDGFRA mutations. ConclusionThe t-RTKS/PDGFRA has high mutations rates in Chinese population with diverse mutation types, and mutations rate of t-RTKS exon 11 is high. The t-RTKS/PDGFRA genotyping may help to choose targeted drug Imatinib and evaluate the dose.

[Key words]Gastrointestinal stromal tumor; c-Kit; Platelet-derived growth factor; Gene mutation

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.008

[文献标志码][中国图书资料分类号]R735A

[文章编号]2095-140X(2015)12-0036-05

[通讯作者]李卫，E-mail:lwaq3356@sian.com

[基金项目][作者单位]400030 重庆市，广西医科大学附属重庆市肿瘤医院胃肠外科(孙浩、李卫)，重庆医科大学2013级医学一系丙三班(孙可心)