流式微球技术定量检测血小板膜糖蛋白在ITP中的应用价值探讨*

基金项目:陕西省西安市科技局资助基金项目(2012014)。

郭　亮，宋艳萍，王　浩，贾学友，郭晓波

(西安市中心医院血液科,陕西西安 710000)



流式微球技术定量检测血小板膜糖蛋白在ITP中的应用价值探讨*

*基金项目:陕西省西安市科技局资助基金项目(2012014)。

郭亮，宋艳萍，王浩，贾学友，郭晓波

(西安市中心医院血液科,陕西西安 710000)

摘要:目的应用流式细胞技术检测血小板表面膜糖蛋白，评价其在血小板减少性紫癜(ITP)诊断中的价值。方法选取2013年1月至2015年2月门诊及住院部收治的77例ITP患者(ITP组)、43例非免疫性血小板减少症患者(NITP组)及同期进行健康体检的健康者30例(健康对照组)为研究对象。应用鼠抗人GPⅡb/Ⅲa单抗、GPIa/Ⅱa单抗、GP Ib/Ⅸ单抗包被微球，采集空腹静脉血分离血样中血小板，将血小板裂解后与包被过的微球共同孵育，应用流式细胞仪结合间接荧光免疫法检测并比较三组血小板表面膜糖蛋白。分析流式微球技术诊断ITP的敏感度与特异度。结果ITP组患者血小板表面GPⅡb/Ⅲa、GPIa/Ⅱa、GP Ib/Ⅸ的水平均明显高于NITP组及健康对照组，差异具有统计学意义(P<0．05)，NITP组患者高于对照组，差异具有统计学意义(P<0．05)。流式微球技术对ITP的诊断敏感度为92.2%(71/77)，特异度为89.0%(65/73)，准确度为90.7%(136/150)。结论应用流式微球技术定量检测血小板膜糖蛋白对诊断ITP有应用价值。

关键词:流式微球技术；血小板表面膜糖蛋白；血小板减少性紫癜；诊断价值

特发性血小板减少性紫癜(ITP)是临床常见的出血性疾病，约占出血性疾病的1/3,患者主要表现为血小板持续减少，皮肤、黏膜出血，严重者可发生内脏甚至颅内出血而危及生命[1]。目前ITP的国内诊断标准仍为排除法，除血小板减少这一项较肯定外，其他诊断标准都是相对的，疗效反应在系统治疗后才能判定，故临床上存在一些难以确诊的病例，影响临床治疗，因此，寻找敏感而特异的检测方法，对提高ITP的诊断有重要意义[2-3]。本研究选取2013年1月至2015年2月本院收治的77例ITP患者为研究对象，探讨流式微球技术定量检测血小板膜糖蛋白在ITP中的应用价值，为其诊断提供依据，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料ITP组：ITP患者77例，均本院2013年1月至2015年2月门诊及住院患者，其中男32例，女45例，男∶女=1.4∶1，年龄14~78岁，平均年龄45岁，均符合ITP诊断标准[4]。NITP组：非免疫性血小板减少患者43例，其中男性26例，女性17例，年龄16～78岁，平均年龄45岁，淋巴瘤患者9例，再生障碍性贫血患者27例，骨髓异常增生综合征患者7例。健康对照组：本院体检中心健康者30例，其中男12例，女18例，男：女为1.5∶1，年龄15～79岁，平均46岁。

1.2仪器与试剂FACSCalibur流式细胞仪(美国Beckon Dickinson公司)。BD FACS Lysing Solution(溶血素)和BD Cailibrite 3 Beads(流式细胞仪校准试剂)等全部为BD进口试剂。QuantumPlex4.4um-carboxy1全部为Bangslabs公司进口微球。

1.3方法微球包被：用200 mg/mL的血小板膜糖蛋白单克隆抗体(抗-GPⅡb/Ⅲa、抗-GPIa/Ⅱa、抗-GP Ib/Ⅸ)分别包被QuantumPlex4.4um微球，抗体包被按照微球荧光从低到高的顺序进行[5]。包被过程如下：200 μL QuantumPlex4.4μm微球l 000 r/min离心15 min，弃上清液。加入400 μL蛋白偶联缓冲液，1 000 r/min离心15 min，弃上清液。加入200 μL蛋白偶联缓冲液和 20 μL浓度为20 mg/mL的EDAC活化剂，活化15 min，加入100 μg抗体，室温包被4 h。1 000 r/min离心15 min，弃上清液，加入400 μL清洗/贮存液，4 ℃存放。流式检测：用200 μL O型血小板和血清在37 ℃下孵育30 min后，用PBS(EDTA，BSA)洗3遍，加入 150 μL血小板裂解液后，放置4 ℃30 min，2 500 r/min离心15 min，取上清液。加入100 μL血小板裂解液，25 μL微球，避光孵育3 h，用PBS(Tween20，BSA)洗2遍，加入羊抗人IgG-FITC、IgM-PE10 μL，避光孵育60 min，用PBS(Tween20，BSA)洗1遍，加400 μL PBS(Tween20，BSA)，上机检测并获取10 000个微球。同时将30个健康体检者人作为对照样本，并得到正常对照几何平均荧光强度(MFI)[5]。

2结果

2.13组血小板膜糖蛋白表达结果比较ITP组患者血小板表面GPⅡb/Ⅲa、GPIa/Ⅱa、GP Ib/Ⅸ的水平均明显高于NITP组及健康对照组，差异具有统计学意义(P<0．05)，NITP组患者高于健康对照组，差异具有统计学意义(P<0．05)。结果见表1。

表1　　三组血小板膜糖蛋白表达结果比较±s)

2.2流式微球技术对ITP诊断价值分析ITP组荧光强度比率均值及上下限为5.47(0.48~19.75)，NITP组为1.23(0.70~4.12)，健康对照组为0.98(0.41~1.62)，ITP组高于NITP组及健康对照组，差异具有统计学意义(P<0．05)。以健康对照组上限为分界值，大于1.62为阳性，小于1.62为阴性，流式微球技术对ITP的诊断敏感度为92.2%(71/77)，特异度为89.0%(65/73)，准确度为90.7%(136/150)。

3讨论

目前ITP的诊断标准主要依据临床表现和多次化验结果，血小板相关免疫球蛋白 (PAIg) 的检测是辅助诊断条件之一，但大量研究显示PAIg升高缺乏特异性，对ITP诊断帮助甚微，因此有研究者探索使用单克隆抗体固定血小板抗原法(MAIPA)及改良的MAIPA来检测血小板膜糖蛋白自身抗体，虽然可以有限的提高自身抗体检测的特异度，但因敏感度低、检测方法繁琐、耗时长等因素而限制了其临床应用。

ITP的发生是由于自身抗体致敏的血小板被单核-巨噬细胞系统过度破坏所致，而自身抗体通常针对的是血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa、GPIb/Ⅸ这些较为重要的靶抗原，除此之外还有GPIa/Ⅱa、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、GMP140等。这些少见类型的抗原决定簇有助于进一步揭示血小板自身抗体加剧ITP的发病机制[6-7]。流式微球技术(CBA)是一种新的高通量检测方法，通过使用不同荧光编码大小的聚合微球，可以同时分析复杂样品中的多种分析物[8]。每一种微球表面被修饰使其与相应的待测抗原或抗体反应，将不同微球混合即可进行多重复合测定，该技术结合了荧光编码微球的特异性与流式细胞仪的高度敏感性。本研究应用流式细胞技术检测血小板表面膜糖蛋白，评价其在ITP诊断中的价值，结果显示：ITP患者GPⅡb/Ⅲa、GPIa/Ⅱa、GP Ib/Ⅸ的水平均明显高于NITP组及健康对照组，而流式微球技术对ITP的诊断敏感度为92.2%(71/77)，特异度为89.0%(65/73)，高于目前临床上应用的PAIg检测(特异度19%~27%)及MAIPA(敏感度39.0%~51.8%)，提示作为一个技术分析平台，流式荧光微球技术大大提高ITP诊断敏感度及特异度，具有较高的推广价值和应用价值。

参考文献

[1]Hezard N,Simon G,Mace C,et al.Is flow cylometry aecurate enough to screen platelet autoantibodies[J].Transfusion,2008,48(2):513-518.

[2]刘凌，冯莹，庞璎，等．骨髓检查和血小板相关抗体检测对免疫性血小板减少症的临床价值[J]．中国医药指南，2011，9(33)：46-47．

[3]任娜，邱广斌，王成彬．流式细胞术检测血小板相关抗体在免疫性血小板减少症中的应用[J]．国际检验医学杂志，2014，35(13)：1689-1690．

[4]张之南，沈悌．血液病诊断及疗效标准[M]．3版．北京：科学出版社，2007：172-176．

[5]李金霖．流式微球技术检测特发性血小板减少性紫癜患者血小板糖蛋白自身抗体的方法建立及临床应用[D]．广州：南方医科大学，2010．

[6]赵赟霄，何杨，朱明清，等．流式免疫微球芯片技术检测血小板膜糖蛋白特异性自身抗体的方法及其临床应用[J]．苏州大学学报:医学版，2012，32(6)：826-829．

[7]何杨，李锦霞，朱明清，等．流式微球技术检测血小板膜糖蛋白特异性自身抗体法的建立临床应用[J]．中华检验医学杂志，2011，34(3)：1-6．

[8]常丽贤，杨林花，陈剑芳，等．应用流式细胞术检测原发免疫性血小板减少症患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的表达及其临床意义[J]．中华血液学杂志，2011，32(9)：630-632．

·临床研究·

收稿日期：(2015-09-22)

文献标识码：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.044A

文章编号：1673-4130(2015)24-3614-02