COXⅠ基因DNA条形码技术在蜱类鉴别中的应用

侯海燕

(淮安市疾病预防控制中心，江苏淮安 223001)



COXⅠ基因DNA条形码技术在蜱类鉴别中的应用

侯海燕

(淮安市疾病预防控制中心，江苏淮安 223001)

摘要:目的探讨细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基(COXⅠ)条形码在野外捕获种类鉴定中的应用。方法对捕获的9个蜱类个体中COXⅠ基因进行测序，利用DNAstar软件进行序列比对及同源性分析，利用phlip3.6软件选择最大似然法(ML)构建进化树。结果在系统进化树中，标本sh2011040702、ra2011042193及ra2011051168与血蜱属分在一支，sh2011051404、sh2011051408及ra2011041177与革蜱属聚集在一起，sh2011051837、sh2011041917及ra2011041175与璃眼蜱属分在一支，均与形态学鉴定结果一致。结论以COXⅠ基因序列作为蜱DNA条形码对蜱种鉴别具有一定的可行性。

关键词:细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基；DNA条形码；蜱类；鉴定

蜱是寄生在动物体表的吸血寄生虫，具有从宿主获得多种病原体的能力。对国内外蜱传播疾病的研究发现，蜱携带的病原体包括83 种病毒(如出血热、新型布尼亚病毒、森林脑炎、)、14 种细菌(如布氏杆菌)、20 种立克次体(如蜱传斑疹伤寒、Q 热、)、18 种螺旋体(如莱姆病)、32 种原虫(如巴贝斯虫)、1 种支原体检验检疫、1 种衣原体、1 种巴尔通体和2 种线虫[1-2]。对蜱进行分类鉴定是医学媒介生物调查和控制工作的基础，是检验检疫、疾病预防与控制领域的核心步骤。

2003年，加拿大科学家Hebert等[3]提出了DNA条码概念，利用线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基(COXⅠ)这一特定基因的特定区段作为DNA条码。由于其操作简便快速，已经被广泛的应用于多个动物类群的鉴定与分类[4-7]。目前，已测定出一些蜱的mtDNA序列[8]。本研究通过对某地区监测所捕获的蜱，选择其中9个线粒体COXⅠ基因序列进行比对分析，分析其种属分类，验证COXⅠ基因作为蜱DNA条形码在蜱种鉴定中的有效性。

1材料与方法

1.1标本采集本研究分别在某地区的6个地点即不同生态环境下进行蜱类的采集。在采样点随机抽取10～30只家畜采集体外寄生蜱，以每只家畜作为1个采集单位,同时在采样点附近布鼠夹，从捕获的啮齿动物体表进行寄生蜱收集，将每个单位采集的蜱按单宿主装入单只大号试管中，做好记录，实验室分类鉴定。

标本的形态学鉴定用体视显微镜观察蜱的盾板、假头、假头基形状、口下板、生殖孔、肛沟、气门等形态特征，根据蜱分类检索表进行形态学分类鉴定。

1.2基因组DNA提取、聚合酶链式反应(PCR)扩增及测序采集的蜱标本，先用75%乙醇清洗1次，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次。蜱基因组总DNA的提取使用Qiagen公司的DNeasy Blood & Tissue Kit，参照试剂盒说明书提取总DNA。以提取的蜱DNA为模板，按照文献中扩增COXⅠ基因的方法进行扩增，扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后由金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.3COXⅠ序列分析方法利用DNAStar程序对序列进行排序辅以手工校正，使用phlip3.60软件进行序列比对并用最大似然法(ML)构建系统发生树。系统树分支的置信度均采用自展法1 000次重复验证。

2结果

2.1蜱的形态学鉴定在某地区6个地点采集蜱，利用体视显微镜观察蜱的盾板、假头、假头基形状、口下板、生殖孔、肛沟、气门等形态特征，根据蜱分类检索表进行形态学分类鉴定发现，羊群体表寄生蜱为亚东璃眼蜱(编号为sh2011051837、sh2011041917)、草原革蜱(编号为sh2011051404、sh2011051408)及草原血蜱(编号为sh2011040702)；鼠类体表寄生蜱为草原血蜱(编号为ra2011042193、ra2011051168)、草原革蜱(编号为ra2011041177)及亚东璃眼蜱(编号为ra2011041175)。

2.2不同蜱COXⅠ基因PCR扩增结果琼脂糖凝胶检测结果显示，COXⅠ的PCR产物约为650 bp的DNA片段，见图1。与预期目的片段大小一致。

2.3蜱的核苷酸序列同源性比较从核苷酸同源比较表中可以看出标本sh2011051837、sh2011041917及ra2011041175与3个已知属的核苷酸相比较，与璃眼蜱属的同源性为86.9%～99.1%，与血蜱属的核苷酸同源性为81.6%～84.9%，与革蜱属的核苷酸同源性为83.2%～83.6%。标本sh2011051837、sh2011041917及ra2011041175之间的核苷酸同源性为99.9%；标本sh2011051404、sh2011051408及ra2011041177与3个已知属的核苷酸相比较，与璃眼蜱属的同源性为80.4%～83.7%，与血蜱属的核苷酸同源性为82.1%～86.1%，与革蜱属的核苷酸同源性为99.0%～99.7%。标本sh2011051404、sh2011051408及ra2011041177之间的核苷酸同源性为99.7%～99.9%；标本sh2011040702、ra2011042193及ra2011051168与3个已知属的核苷酸相比较，与璃眼蜱属的同源性为79.5%～83.0%，与血蜱属的核苷酸同源性为85.2%～99.0%，与革蜱属的核苷酸同源性为81.4%～83.1%。样本sh2011040702、ra2011042193及ra2011051168之间的核苷酸同源性为99.9%。

M:标志物；1:sh2011041917；2:sh2011040702；3:sh2011051404；4:ra2011041175 5:ra2011051168。

图1COXⅠ基因PCR扩增产物电泳图

图2　　基于ML法的建立的蜱COXⅠ基因分子化树

2.4蜱的系统发生树的构建基于本研究的9个个体线粒体COXⅠ基因序列，以及从Genebank中所获得的已知蜱的各属(包括璃眼蜱属、革蜱属、血蜱属)序列，ML法建系统发生树，如图2所示。sh2011051837、sh201104197及ra2011041175的系统发生树与璃眼蜱属的种分在一支，同时这3株聚集在一起，从羊群体表分离出的蜱与从鼠表分离到的蜱的进化关系较近，没有发现明显的因宿主差异导致的蜱COXⅠ基因发生变异，同时与形态学鉴定结果一致为亚东璃眼蜱；sh2011051404、sh2011051408及ra2011041177在系统发生树中与革蜱属聚集在一起，但与同一大支相比，这三株又独立聚集在一起，且自展值为100，与形态学鉴定一致，为草原革蜱；标本sh2011040702、ra2011042193及ra2011051168与血蜱属的分在一支，与形态学鉴定一致。

3结论

本研究对某地区3种蜱的9个个体的COXⅠ序列进行扩增，得到650 bp基因片段，经测序后进行分析，标本sh2011051837、sh2011041917及ra2011041175与3个已知属的核苷酸相比较，与璃眼蜱属的同源性为最高，与形态学鉴定这3个为亚东璃眼蜱的结论一致；标本sh2011051404、sh2011051408及ra2011041177与三个已知属的核苷酸相比较，与革蜱属的核苷酸同源性最高，与形态学鉴定这3个为草原革蜱的结论一致；标本sh2011040702、ra2011042193及ra2011051168与3个已知属的核苷酸相比较，与血蜱属的核苷酸同源性最高，与形态学鉴定这3个为草原血蜱的结论一致。

对于物种的鉴定，一般采用传统形态学方法，但由于个体差异、环境影响等因素常常使得形态学鉴定也具有很大的局限性[9]，尤其是形态学特征很相似，标本破坏，特定状态下(如缺乏未成熟蜱的性状描述或采集的标本为饱血蜱)。DNA 条形码技术是建立在物种相对保守的基因如12S rDNA、16rDNA、COXⅠ基因、Cytb基因、D-loop基因等基础上的，通过获得相对保守的基因序列，可以建立每种物种便于识别的特有便签[10-11]。近年来，蜱传疾病引起重大的公共卫生安全，引起越来越多的重视，但是对于蜱本身的关注较少，尤其是在蜱携带病原体种类的鉴定。DNA条形码技术的引入便可以更加快速、准确地鉴定蜱，同时为依据分子标记序列鉴定物种、种群研究及系统进化分析提供了有效途径。

本研究结果表明，线粒体COXⅠ基因作为DNA条形码用于蜱种类鉴别具有一定的可行性，利用DNA条形码检测技术是准确鉴定物种的趋势之一。

参考文献

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·论著·

Application of DNA barcoding technique of COXⅠ gene in identification of ticks

HouHaiyan

(HuaianMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Huaian,Jiangsu223001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the application of the cytochrome C oxidase subunit Ⅰ gene(COXⅠ) barcoding in the identification of wild-caught ticks.MethodsThe COXⅠ gene of 9 caught tick individuals with different species was sequenced,the DNAstar software was used to conduct the sequence comparison and homology analysis.Meanwhile the philp3.6 software was adopted to select the maximal likelihood(ML) method for constructing the evolutionary trees.ResultsIn the phylogenetic trees，the samples of sh2011040702,ra2011042193 and ra2011051168 with Haemaphysalis were in a branch,sh2011051404,sh2011051408 and ra2011041177 with dermacentor were clustered together,and sh2011051837,sh2011041917 and ra2011041175 with hyalomma were in a branch,which were consistent with the morphological identification results.ConclusionMaking the COXⅠ gene sequence as tick DNA barcoding has certain feasibility for identifying the tick species.

Key words:cytochrome C oxidase subunit Ⅰ gene;DNA barcoding;tick;identification

通讯作者：

作者简介：张书凤，女，主管检验师，主要从事临床免疫与微生物学检验工作。△E-mail：dtjykhua@126.com 。

收稿日期：(2015-07-26)

文献标识码：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.026A

文章编号：1673-4130(2015)24-3570-02