血流感染金黄色葡萄球菌克林霉素耐药与分子流行病学研究*

基金项目:陕西省自然科学基金资助项目(2014JM4188)。



血流感染金黄色葡萄球菌克林霉素耐药与分子流行病学研究*

*基金项目:陕西省自然科学基金资助项目(2014JM4188)。

周珊1，张蓓2，徐修礼1△，冯琳涵1，刘家云1，马越云1，郝晓柯1

(1.第四军医大学西京医院全军临床检验医学研究所,陕西西安 710032；

2.西安交通大学附属西安市红十字会医院检验科，陕西西安 710054)

摘要:目的了解2014年全院血流感染金黄色葡萄球菌红霉素对克林霉素诱导耐药基因情况及分子流行病学分析。方法收集2014年全年临床血液标本分离的金黄色葡萄球菌。以双纸片法筛选红霉素对克林霉素诱导耐药的表型。erm基因检测采用PCR方法，并用spa及多位点序列分型(MLST)方法了解不同erm型分子流行情况。结果33株金黄色葡萄球菌中MRSA分离率78.79%。且MRSA均携带有ermA基因。在7株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)中，4株分别携带ermB或ermC基因。spa及MLST结果显示，该院血流感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)以ST239-t030型别为主；而MSSA存在较多型别，如ST59-t437、ST398-t3625等。结论MRSA有较高分离率，主要以ST239-t030克隆株为主。erm基因主要以ermA检出为主(86.67%)。菌株对抗菌药物耐药明显，实验室应加强对克林霉素诱导耐药的检测，以指导临床合理使用抗菌药物。

关键词:血流感染；金黄色葡萄球菌；erm基因；流行病学；耐药性

金黄色葡萄球菌是引起医院和社区化脓性感染的主要病原菌。特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的感染，已经成为引起医院内感染首要的病原菌[1]，尤其是MRSA引起的血流感染。由于MRSA往往呈现多重耐药、治疗困难、病死率高等特点，更是受到临床及科研的广泛关注。在临床抗感染治疗中，克林霉素由于其较强组织渗透性及低廉价格等优点，使其成为治疗金黄色葡萄球菌感染中对青霉素过敏患者的首选药物[2]。因此，了解黄色葡萄球菌对克林霉素耐药机制，正确检测及解读克林霉素体外药敏试验至关重要。

本研究对2014年临床分离的血流感染患者33株金黄色葡萄球菌进行鉴定及药敏试验,用头孢西丁纸片扩散法判读MRSA，以双纸片法(D实验)筛选红霉素对克林霉素诱导耐药表型，PCR方法检测克林霉素诱导耐药erm基因，并联合spa及多位点序列分型(MLST)方法以了解不同erm型分子流行情况。为临床合理使用抗菌药物及院内控制提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料收集2014年全年血培养标本分离的金黄色葡萄球菌33株；质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923。

1.2仪器与试剂培养基及药敏纸片购于英国OXOID公司，PCR反应试剂和溶葡萄球菌酶购于上海生工生物公司，DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司，全自动细菌药敏鉴定分析仪phoenix-100、基因扩增仪、电泳仪等购自美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1药敏试验方法采用K-B纸片法和phoenix-100全自动细菌鉴定分析仪，按CLSI2014规定的标准进行[3]。

1.3.2耐甲氧西林葡萄球菌确定以头孢西丁纸片法及phoenix-100全自动细菌鉴定分析仪联合检测，参照CLSI2014规定的判定标准进行[3]。

1.3.3红霉素对克林霉素诱导耐药表型确定根据CLSI2014推荐标准，在距离红霉素纸片(15 μg/片)20 mm处贴含有克林霉素的纸片(2 μg/片)，35 ℃孵育16～18 h,克林霉素抑菌环在近红霉素一侧缩小或出现截平现象，即呈“D”形，则说明存在诱导性克林霉素耐药，D试验阳性。

1.3.4金黄色葡萄球菌全基因组DNA提取依据德国Qiagen公司的基因提取试剂盒进行细菌全基因组提取，最后用100 μL Elution Buffer将DNA洗脱。用eppendorf的Biophotometer plus测定基因组DNA纯度及浓度后放-80 ℃冰箱备用。

1.3.5erm基因检测根据金黄色葡萄球菌erm基因序列分别设计ermA、ermB及ermC引物，并由上海生工公司合成。以提取的金黄色葡萄球菌基因组为模板在退火温度55 ℃下进行PCR，产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.3.6spa分型基于金黄色葡萄球菌A蛋白基因X区呈现多态性，建立spa分型方法[4]。在退火温度为60 ℃的条件下进行PCR操作。产物送上海生物工程公司测序，测序后结果在该网站进行比对分析。

1.3.7MLST分型依据金黄色葡萄球菌7个管家基因(arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil)不同，对细菌进行分型。PCR反应引物及反应体系参考文献[5]。PCR产物测序后，进行比对确定ST型别。

1.4统计学处理耐药数据采用WHONET5.6软件进行数据分析。

2结果

2.1药敏及表型确认试验33株金黄色葡萄球菌，头孢西丁耐药菌株26株，故MRSA为26株，占78.79%。33株细菌中有3株为红霉素和克林霉素全敏感菌株，其他30株金黄色葡萄球菌均对红霉素和克林霉素同时耐药。对克林霉素耐药形式存在诱导型耐药(即D实验阳性)和结构型耐药(见图1)，诱导耐药为13株，占克林霉素耐药菌的43.33%，结构耐药17株，占56.67%。

A:结构型耐药；B:诱导型耐药。

图1金黄色葡萄球菌对克林霉素耐药表型

2.2erm基因检测结果33株金黄色葡萄球菌中，30株细菌均携带有erm基因，携带率为90.91%(30/33)。携带ermA基因的为26株，占检出erm基因的86.67%(26/30)，仅3株菌携带ermB基因，占10%(3/30)，7株菌携带ermC基因，占23.33%(7/30)。同时携带ermA和ermC基因有6株细菌，占20%(6/30)，仅有1株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)只携带ermC基因。菌株erm基因分型结果见图1。

M:DNA标志物；1:ermA (共20株);2:ermB(共3株);3:ermC(共1株);4:ermA+ermC(共6株);5:未检出erm基因(共3株)。

图233株菌erm基因分型结果

2.3菌株spa及MLST分型结果spa分型结果显示，33株金黄色葡萄球菌共存在8个spa型别，spa分型PCR产物见图2，相对分子质量在300 bp左右。其中t030为24株占72.73%，为主要型别。其他型别还有t437(2株占6.06%)、t037(2株占6.06%)、t002、t3625、t2092、t091、t1793各1株。对7个管家基因(gmk、glpF、aroE、tpi、yqil、arcC、pta)进行PCR，产物测序比对后显示，共存在6个ST型别：ST239(26株占78.79%)；ST59、ST398均为2株(占6.06%)；ST121、ST7、ST5均为1株。并且所有的MRSA均为MST-ST239型别。

M:DNA标志物；1:spa-t030;2:spa-t2092;3:spa-t1793;4:spa-t037;5:spa-t3625;6:spa-t437;7:spa-t091;8:spa-t002。

图3不同spa型别PCR反应产物

2.4erm基因在不同型别菌株中分布菌株分子型别与erm基因携带及耐药数据分析见表1。从数据中可以看出，在33株血流感染金黄色葡萄球菌中，MRSA菌株26株，同时所有MRSA菌株均为ST239型别。依据spa和MLST联合分型来看，MRSA菌株除2株细菌为ST239-t037，其他24株菌均为ST239-t030。ermA基因只在MRSA菌株中检出。且红霉素诱导克林霉素耐药表型共13株，均携带ermA基因。结构性耐药表型携带erm基因种类较多。其中有6株结构型耐药细菌同时携带ermA和ermC基因。

表1　　erm基因在不同型别菌株中的分布情况

续表1　　erm基因在不同型别菌株中的分布情况

3讨论

金黄色葡萄球菌是引起各种重症感染的主要病原菌之一[6]，近年来由于抗菌药物的不合理使用，使MRSA的检出率逐年增加并呈现多药耐药的趋势[7]。并且统计数据显示MRSA耐药率明显高于MSSA[7]。MRSA不仅仅对β-内酰胺类、酶抑制剂复合抗菌药物及碳青霉烯类耐药，大部分同时对大环内酯类，林可霉素类，喹诺酮类等均有较高耐药率[7]。众所周知，金黄色葡萄球菌引起的血流感染，患者病情凶险，治疗难度大[8]。所以MRSA血流感染的治疗相当棘手。并且数据资料显示临床分离自血流感染的金黄色葡萄球菌对红霉素和克林霉素的耐药率均大于50%[8]。因此，了解金黄色葡萄球菌对红霉素和克林霉素耐药产生机制，对感染预防治疗极其重要。

金黄色葡萄球菌对红霉素和克林霉素的耐药机制主要有两种，一种是能量依赖的主动泵出机制，一种是由erm基因编码导致23SrRNA甲基化，通过降低药物对核糖体的结合而产生的耐药。erm基因介导的耐药，在表型上分为两种，即诱导型耐药和结构型耐药[9]。

本研究数据显示，本院2014年临床分离血流感染金黄色葡萄球菌患者共33株，MRSA分离率为78.79%，且所有MRSA菌株均为ST239并检出ermA基因。说明ermA基因主要存在于MRSA中。与文献报道不同[8-9]，ermB仅在3株MSSA结构型耐药菌株中检出，同时只有1株MSSA菌株检出只携带ermC基因，单独携带ermB或者ermC基因检出率较低。在诱导型耐药菌株中，只检出ermA基因。这些现象可能与地域分布存在密切关系[10]。

从红霉素和克林霉素耐药上来看，33株金黄色葡萄球菌中30株细菌存在耐药，耐药率高达90.91%，且诱导型耐药表型占相当比例(43.33%)。证明本院红霉素和克林霉素耐药现象比较严重。但由于目前微生物自动化鉴定及药敏仪器的逐步普及，大部分三甲医院已不再用克林霉素纸片法检测药敏，而是直接通过自动化仪器的微量稀释法报告MIC结果。这使得诱导型克林霉素耐药菌株出现漏检现象，可能会导致临床治疗的失败。所以，提倡实验室在自动化仪器鉴定药敏时，能够采用D试验检测诱导型耐药表型。该方法简单易行，适合临床实验室推广。

从分子表型上来看，13株诱导型耐药菌均为ST239-t030型MRSA菌株，并且全部携带ermA一种耐药基因。而17株结构型耐药菌株携带的erm基因型别较多。此数据说明，在本院红霉素克林霉素诱导型耐药主要由ermA基因所致，且该菌株型别为ST239-t030型MRSA。同时证明该型别菌株存在克隆传播现象，因此，临床感染工作人员应加强生物安全观念，提高耐药菌株检出率，及时采取有效的控制措施，有效防止耐药菌株产生及传播。

参考文献

[1]姚蕾，徐元宏．金黄色葡萄球菌致病毒素的研究进展[J]．国际检验医学杂志，2014，35(22)：3080-3082．

[2]乔昀，陈君灏，罗云桃，等．146例金黄色葡萄球菌中红霉素对克林霉素诱导耐药分析[J]．检验医学，2012，27(2)：114-117．

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.M100-S24 Performance standards for antimicrobial susceptibilitv testing：twenty-fourth informational supplement[S]．Wayne,PA,USA:CLSI,2014．

[4]占志平，童俊．无菌体液标本中异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌的流行病学研究[J]．国际检验医学杂志，2015(8)：1117-1119．

[5]吴财铭，栗俊杰，廖奇峰，等．重症监护病房患者金黄色葡萄球菌感染的分子流行病学研究[J]．国际检验医学杂志，2015，36(9)：1253-1254．

[6]沈定霞，罗燕萍，徐雅萍，等．葡萄球菌对红霉素和克林霉素的诱导耐药性研究[J]．中华检验医学杂志，2005，28(4)：400-402．

[7]李耘，吕媛，薛峰，等．卫生部全国细菌耐药监测网(Mohnarin)2011-2012年革兰阳性菌耐药监测报告[J]．中国临床药理学杂志，2014，30(3)：251-259．

[8]王立新，胡祎明，胡志东，等．血流感染患者金黄色葡萄球菌erm基因检测及流行病学研究[J]．检验医学，2013，28(3)：189-193．

[9]宋娟．220株金黄色葡萄球菌中红霉素对克林霉素诱导耐药分析[J]．国际检验医学杂志，2014，35(17)：2384-2385．

[10]孙茜，贾曦，王聪．金黄色葡萄球菌耐药表型及基因型研究[J]．国际检验医学杂志，2014，35(4)：424-425．

本刊声明

《国际检验医学杂志》2015年36卷第8期刊发文章《胰岛素泵联合诺和灵30R治疗糖尿病合并肺部感染的疗效及检验指标分析》一文，通讯作者为王莹，电子邮箱：150476755@qq.com。

《国际检验医学杂志》编辑部

2015-12-30

·论著·

Study on clindamycin resistance and molecular epidemiology of bloodstream infection by Staphylococcus aureus*

ZhouShan1,ZhangBei2,XuXiuli1△,FengLinhan1,LiuJiayun1,MaYueyun1,HaoXiaoke1

(1.PLAResearchInstituteofClinicalLaboratoryMedicine,XijingHospital,FourthMilitaryMedical

University,Xi′an,Shaanxi710032,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,Affiliated

Xi′anRedCrossHospital,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710054,China)

Abstract:ObjectiveTo understand the clindamycin resistance gene and molecular epidemic of Staphylococcus aureus in the patients with bloodstream infection in our hospital during 2014.MethodsThe clinical isolates of Staphylococcus aureus in clinical bloodstream infection were collected during 2014.The phenotype of erythromycin to clindamycin induced resistance was assessed by D test.The erm gene was detected by PCR.The different erm types of the molecular epidemiology of Staphylococcus aureus were studied by spa and MLST typing.ResultsIn 33 strains of Staphylococcus aureus,the isolation rate of MRSA strains were 78.79%,moreover all of MRSA strains carried ermA gene.In 7 strains of methicillin sensitive Staphylococcus aureus(MSSA),4 strains respectively carried ermB or ermC gene.The results of MLST and spa results showed that the main type of MRSA in our hospital was ST239-t030.But MSSA had more types,such as ST59-t437,ST398-t3625 and so on.ConclusionMRSA has higher isolation rate in our hospital,which is dominated by ST239-t030 type.For the detection of gene erm,ermA (86.67%) is the main type.The strains are obviously resistant to antibacterial drugs.The laboratory should strengthen the detection of clindamycin induced resistance for guiding the clinical rational use of antibacterial drugs.

Key words:bloodstream infection;Staphylococcus aureus;erm gene;epidemiology;drug resistance

收稿日期：(2015-08-02)

文献标识码：

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2015.24.004A

文章编号：1673-4130(2015)24-3517-03

通讯作者△,Email:xxlxxl@fmmu.edu.cn。

作者简介：周珊，女，主管检验技师，主要从事微生物诊断及耐药机制研究。