长链非编码RNA对免疫应答调节的研究进展

安志远

(首都医科大学附属北京朝阳医院医学研究中心，北京100020)

长链非编码RNA对免疫应答调节的研究进展

安志远

(首都医科大学附属北京朝阳医院医学研究中心，北京100020)

lncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ转录生成，长度大于200个核苷酸的长链非编码RNA，它没有开放读码框，不能翻译成蛋白质，曾被认为是基因组中的“暗物质”。目前科学家们还没有精确掌握其功能信息以及全部的二维和三维结构,所以很难对lncRNA进行分类，现在是通过lncRNA和蛋白编码基因的相对位置对其进行分类的。lncRNA可以分成5类[1,2]：① 位于蛋白编码基因内含子的内含子lncRNA。②从蛋白编码基因区转录出的长链基因间非编码RNA(lincRNA)。③直接和蛋白编码基因的启动子作用的可以双向转录的lncRNA。④从蛋白编码基因外显子转录出的反义lncRNA。⑤从不能翻译出蛋白的基因区转录出的假基因lncRNA。研究表明lncRNA通过与靶基因的启动子和增强子结合来调节基因表达。虽然lncRNA没有编码功能，但它可以利用RNA-RNA、RNA-DNA、RNA-蛋白相互作用，通过剪切、降解核酸、捕获RNA和干扰翻译等方式对转录过程进行调节。在细胞质中，lncRNA不仅可以和靶mRNA直接作用控制其表达和翻译，而且可以和特殊信号蛋白作用调节特殊基因的表达。细胞核内的lncRNA也在表观遗传调控上扮演重要角色[3,4]。lncRNA可以通过信号传导、指引或引诱其他分子等方式来调节基因表达。lncRNA还可以和蛋白质、转录因子、调节因子相互作用,改变表观遗传修饰(例如Gas5和Lethe)。它们也可以作为“分子海绵”捕获miRNA和剪切因子。lncRNA可以通过顺式作用募集染色质修饰或通过反式因子作用到目标DNA上。lncRNA作为中间体使多种蛋白和核酸建立联系，通过组蛋白修饰与稳定核结构或作为信号复合物从而改变染色质功能。lncRNA调节基因的机制是错综复杂的，它具有不同的序列结构以及结构域，可以利用这些特点去调节生物的功能和完整性。在时空上激活或抑制转录活动。很多证据表明lncRNA在基因转录和转录后调节等很多生物学过程中发挥了重要作用。例如X染色体的失活(Xist/Tsix)[5]、基因印记(H19和Air)[6]、干细胞多能性[7]、癌转移(HOTAIR)[8]、和动脉粥样硬化(Anril)[9]。近来lncRNA在控制免疫系统基因表达的功能也开始被关注。lncRNA广泛表达在包括单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞中；与它们的发育、分化、激活密切相关。

1 lncRNA和固有免疫

1.1 2009年Guttman[10]第一次报道了lncRNA可以调节固有免疫应答。从那以后，许多lncRNA与固有免疫系统联系到一起，例如Lethe、PACER、THRIL和NEAT1，它们可以控制免疫基因的表达和免疫细胞功能[11-13]。lincRNA-COX2是一个51 kb大小的lncRNA，位于小鼠一号染色体上，作用在环氧合酶2基因(COX2)的下游51 kb位置，lincRNA-COX2介导LPS刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)引起TLR4辅助的NF-κB信号激活，但是对TLR3激活很微弱[10]。随后发现，lincRNA-COX2对不同炎症基因表达有负向调节作用，通过TLR配体(LPS、Pam3CSK4)和微生物抗原(单核细胞李斯特菌、仙台病毒)触发产生,其表达受TLR的配体MyD88介导和依赖NF-κB方式[14]。lincRNA-COX2抑制700种基因表达，包括趋化因子(CCL5和CX3CL1)和干扰素刺激基因(ISG)(Irf7、Isg15、Ifi204、 Oas2)，可以介导大量基因表达(IL6、Tlr1、IL-23a)。lincRNA-COX2的转录抑制作用通过与核不均一核糖核蛋白A/B(hnRNP-A/B)和 A2/B1相互作用而实现。lincRNA-COX2敲除小鼠也已经问世，会为将来研究动物体内lncRNA的免疫功能发挥作用[15]。PACER(p50辅助的COX2基因外RNA)是一个和PTG2(COX2)转录起始位点上游直接作用的反义lncRNA[16]。它通过顺式作用在COX2启动子上游，导致LPS/PMA刺激下的人乳腺上皮细胞和人单核巨噬细胞系中COX2的表达。PACER的功能是隔绝p50，抑制NF-κB复合物的亚基使其远离COX2启动子。PACER的表达受到CTCF( the chromatin boundary/insulator factor) 和黏合蛋白cohesin结合成的复合物控制，CTCF结合在COX2的启动子上使染色质开放，增加H3K4甲基化和H4K8乙酰化，并减少5′UTR和上游远端位置的H4K20三甲基化从而引起PACER表达变化。Lethe被证实是一个功能型假基因lncRNA(Rps15a-ps4)[17]。它可在肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1β和糖皮质激素受体兴奋剂地塞米松诱导小鼠胚胎成纤维细胞激活。用前炎症因子和抗炎试剂处理后，Lethe的表达增加，之后它直接和RelA同源二聚体结合，封闭RelA-DNA，减弱NF-κB依赖的炎症反应，但是它不能对微生物元件进行应答。更有趣的是，Lethe与衰老也有很强的相关性，与幼鼠相比，成年鼠的lethe选择性下调，年龄相关的Lethe表达缺失可以引起NF-κB激活增加。Lethe是第一个被证明可以影响反馈环和信号网络的假基因。

1.2 THRIL(也被称为linc1992)是从人THP1单核细胞系中筛选出的具有免疫调节功能的lincRNA，它的全称是TNF-α和不均一核糖核蛋白L(hnRNPL)[18]。THRIL在人组织中广泛表达，大约2 kb长，与基因编码BRI3结合蛋白(Bri3bp)的3′UTR区局部重合。THRIL和hnRNPL相互作用形成转录激活复合体，之后连接到TNF-α的启动子区调节其表达。当炎症刺激时，分泌的高浓度TNF-α通过负反馈调节，使得THRIL表达降低，进而下调TNF-α，从而控制了过度的炎症反应。通过RNA-seq分析，在THRIL缺陷的细胞系中，THRIL可以对免疫基因的表达产生广泛影响(共454个基因)。当THRIL被敲除后，98%的免疫应答基因被下调，这表明THRIL可以控制这些免疫应答基因的表达。值得注意的是，减少THRIL的表达对急性川崎病治疗是有帮助的，将来可以开发出针对THRIL的药物治疗人类炎症免疫性疾病。NEAT1(核旁斑集合因子1)是一个4 kb非拼接的非多聚腺苷酸，它是从人的成纤维细胞和淋巴母细胞中发现的，对核旁斑体的形成是必需的[19]。它可以被双链RNApolyI:C、流感病毒、HSV和TLR3配体激活形成更大的旁斑。它和富含脯氨酸/谷氨酰胺的剪接因子(SFPQ)复合体结合作用在IL-8启动子区来抑制IL-8的表达。CHIP试验确认基础水平的SFPQ便可以和IL-8作用抑制其表达。NEAT1与SFPQ结合后，导致SFPQ从IL-8启动子区域转位到核旁斑上，通过TLR-p38信号途径激活IL-8的转录[20]。lnc-IL7R由LPS刺激产生，它和人的IL7R的3′UTR重合。敲除lnc-IL7R可以导致IL-7R、IL-8、血管细胞黏附蛋白1(VCAM-1 )和E选择素的表达增加。这些靶基因表达改变是通过敲除lnc-IL7R从而减少了启动子区组蛋白H3K27三甲基化抑制而发挥作用[21]。lnc-IL7R是怎样调节H3K27而影响靶基因的还需要研究，在老鼠中是否存在同源的lnc-IL7R还不清楚。Wang等[22]从人树突状细胞中鉴定出lnc-DC。敲除lnc-DC后，单核细胞不能分化成树突状细胞，另外还减弱了树突状细胞辅助激活T细胞的能力。lnc-DC和信号转导和转录激活体3(STAT3)在细胞质中相互作用，促进STAT3的磷酸化，阻止STAT3和Src同源域2磷酸化结构域(SHP1)结合，维持了STAT3的去磷酸化。lnc-DC可以在细胞质中启动STAT3激活，促进树突状细胞分化基因表达，影响固有免疫反应。AS-IL1α由Chan等[23]在2015年发现。它是在李斯特菌感染或TLR配体(LPS、Pam3CSK4和PolyI:C)刺激下产生的。它可以调节IL-1的转录，用shRNA敲除AS-IL1α结果减少了IL1α蛋白的表达。AS-IL1α定位在细胞核，可以募集RNA聚合酶Ⅱ到IL1α位置。它的功能在人和鼠的进化上是保守的。

2 增强子RNA和固有免疫

细胞转录通过染色质、组蛋白和DNA修饰，以及利用增强子和募集转录因子而实现。增强子显示出进化上的保守性，在转录反应中发挥着关键作用[24]。De Santa[25]通过CHIP-seq第一次证实在免疫细胞中非编码RNA转录本可以从增强子区中转录出来。增强子区以特殊组蛋白标志为分类依据，包括组蛋白3第4位赖氨酸单甲基化(H3K4me1)。De Santa发现RNA聚合酶Ⅱ可以作用在增强子区域并导致这一区域的转录。用LPS刺激C57BL/6小鼠巨噬细胞可以产生大量的这类转录本。这些转录本的特点为单链特异性、核定位、多聚腺苷酸化和极高的不稳定性。LPS介导的转录本被浓缩在转录因子结合位上，介导LPS刺激的下游基因IRF3和NF-κB激活。这些增强子RNAs在mRNA的上游，因此可能对非编码RNA产生调节，但作用时间很短暂并且很不稳定。它们可以控制组蛋白修饰，通过顺式作用激活临近基因[26]。

Lam证实了在基础水平和炎症刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞后增强子RNA(eRNA)发挥的特殊转录作用。他发现eRNA转录本对增强子发挥功能很重要。其中Rev-Erb在抑制增强子转录方面发挥重要作用，用CHIP-seq发现，eRNA的初始化发生在80%的Rev-Erb结合位，Rev-Erb功能的丢失和获得可以靶向降解的eRNA转录体，从而改变临近蛋白编码基因的表达[27]。IL-1β-eRNA和IL-1β-RBT46是从人单核细胞RNA测序中筛选出来的。它由LPS介导生成，是一个增强子RNA，可以在IL-1β位点附近双向转录[28]。它们都定位于细胞核，调节NF-κB和LPS介导的mRNA转录，释放IL-1β和CXCL8前炎症因子，敲除IL-1β-eRNA后可以减少ILβ和CXCL8的表达。另一个研究提示，它可以和IL-1β启动子的5′UTR的序列互补，反义转录IL-1β，通过改变IL-1β启动子附近染色质结构，减少H3K4的三甲基化从而抑制IL-1β的表达[29]。在干扰素刺激的人肝细胞全基因组表达中筛选出大约200种干扰素介导的lncRNA[30]。其中AC017076.5(被称为lncRNA-CMPK2)表达水平最高,它位于蛋白编码基因：干扰素刺激基因(ISG)下游。lncRNA-CMPK2抑制一些抗病毒ISG基因表达，可以提高HCV病毒复制，使HCV感染加重，说明干扰素介导的lncRNA-CMPK2在体内对干扰素应答有负性调节作用。这一结果提示我们可以合成IFN介导的lncRNA来控制抗病毒干扰素应答，从一个新层面调节干扰素应答。

3 lncRNA和适应性免疫

3.1 淋巴细胞是参与适应性免疫的主要细胞。现已明确淋巴细胞可以表达大量的lncRNA，它们在淋巴细胞的分化和激活中发挥重要作用。其中有2种lncRNA在人T淋巴细胞中表达，分别是CD4+T细胞中的非编码转录体(NTT)和NRON[31]。它们是最早从免疫细胞中鉴定出的lncRNA。NTT是一个17 kb的多聚腺苷酸、是定位在细胞核的未剪切的基因间转录本。NTT主要表达在活化的人CD4+T细胞中，但其功能还有待明确。NTT与INF-γR 存在功能联系，INF-γR基因与NTT共定位于染色体的同一区域(6q23-q24)，它们在激活T细胞时同步表达[31]。NRON是第一个从人T细胞中鉴定出来的内含子lncRNA，NRON通过与NFAT(钙活化转录因子)相互作用，调节活性T细胞中IL-2的表达。NRON通过和输出蛋白β家族(包括核输出因子KPNB1)相互作用，干扰NFAT的核输出(不能转录激活)[31]。随后的研究表明NRON是一个具有脚手架结构，可以引起隔绝失活作用的lncRNA[包括细胞质蛋白-RNA复合体中磷酸化的NFAT，以及含有GTP酶激活蛋白的IQ模体(IQGAP)和一些NFAT激酶]。NRON最重要的功能是控制T细胞中IL-2的表达。NRON在淋巴组织中表达丰富，调节T细胞中NFAT的激活[32，33]。Pang等[34]第一次证明CD8+T细胞中lncRNA转录本的存在。他从小鼠基因组中鉴定出100多种lncRNA，这些lncRNA都是淋巴细胞特异的，并在原始淋巴细胞和记忆效应CD8+T细胞中表达[34]。从C57BL/6小鼠T细胞全基因转录本中鉴定出1 524种lincRNA，它们存在于早期原始细胞到终末分化细胞的各阶段细胞中。在CD4+T细胞分化成Th1和Th2细胞的过程中，这些表达在T细胞上的lincRNA被T细胞系特殊的转录因子驱使，其中T-bet和Stat4指导Th1细胞分化、Stat6和Gata3指导Th2细胞分化。Th2细胞特异性lincRNA-lincR-Ccr2-5′AS，它位于细胞趋化因子Ccr2基因上游，直接被反义链转录[35]。lincR-Ccr2-5′AS和Gata3一起，控制着免疫基因在Th2细胞的表达，这个lincRNA也控制着体内Th2细胞向肺部移动，还控制着许多趋化因子受体的表达(Ccr1、Ccr3、Ccr2、Ccr5)。它们都坐落在基因组的同一区域[35]。但lincR-Ccr2-5′AS控制这些基因表达的分子机制还不清楚。另外，大量的其他lincRNAs也特异地表达在CD4+T细胞的各种亚群上，原始细胞、Th1细胞、Th2细胞，Th17和调节型T细胞(Treg)[35]。但是，是lincRNAs的哪个部分影响了T细胞的发育和功能还要进一步研究。另一个表达在人T细胞上的lincRNA是生长停滞特异性转录本5(GAS5)，它与雷帕霉素拮抗剂引起的细胞周期停滞反应相关而与营养剥夺无关[36,37]。

3.2 B细胞分泌抗体引起体液免疫应答，其中也有lncRNA的参与。反义lncRNA FAS反义转录本1(Fas-AS1)控制着溶解性Fas受体的产生，在人B细胞淋巴瘤中Fas受体与Fas配体相互作用调节着Fas介导的细胞凋亡[38]。Fas-AS1结合剪切因子RBM5，抑制RBM5介导的Fas第6外显子的选择性跳跃。因为血清sFas水平对非何杰金淋巴瘤诊断价值不大，Fas-AS1lncRNA就成为一个治疗此病潜在的靶点[39]。除此之外，鼠的B细胞免疫球蛋白重链可变区也存在广泛的反义基因间转录，这一过程与染色质重塑下VDJ重排产生的多种抗原受体也存在关系。但lncRNA在B细胞成熟和功能上扮演的角色还存在争议。总之，这些研究表明免疫系统可以产生大量的lncRNA，它们中的许多对宿主免疫防御起到关键作用[40,41]。

4 宿主和病原体相互作用中的lncRNA

不同类型的病原，包括细菌、病毒和寄生虫感染宿主都会产生功能性的lncRNA，它可以通过反馈控制调节宿主和病原体的相互作用，一些lncRNA对宿主有益，可以帮助其阻止感染；但另一些lncRNA，例如许多病原体派生的lncRNA，对侵袭宿主的病原菌起保护作用，破坏宿主免疫系统。

4.1 宿主和病原体相互作用派生的lncRNA 2006年研究人员第一次报道了lncRNA可以调节病毒感染，在日本脑炎病毒和狂犬病病毒引起的小鼠中枢神经系统紊乱中，病毒介导的lncRNA(VINC)发挥作用[42]。VINC是一个长度为3.8 kb，表达在鼠的很多非神经组织以及早期胚胎发育中。利用深度测序技术，在冠状病毒感染引起鼠的SARS中发现了500种注释lncRNAs和1 000种非注释基因区的不同表达[43]。与此同时，在SARS-CoV和流感病毒感染鼠中又发现了相似的lncRNA，说明lncRNA在呼吸系统病毒感染中确实存在，它也可以作为一个研究lncRNA的生物和调节作用的模型。Tmevpg1(也称为NeST或IFNG-AS1)位于临近IFN-γ编码基因下游的Tmevp3基因上，这是一个对Theiler病毒敏感的基因。IFN-γ编码部分的反义DNA链编码NeST RNA，它有6个外显子，914 bp长，位于鼠的10号染色体，表达在CD4+T、CD8+T和NK细胞上。通过RIP和ChIP分析，NeST RNA和WDR5结合，它是一个MLL/SET1 H3K4甲基化酶复合物的亚基，在Ifng位置修饰染色质。NeST RNA介导CD8+T细胞分泌IFN-γ，转基因鼠过表达NeST后对Theiler病毒有保护作用，导致Theiler病毒抵抗[44]。A型流感病毒感染引起全球性健康威胁，但是流感病毒和宿主相互作用的机制还难以找到，利用NCode和SureprintG3 微阵列技术鉴定出42种lncRNA在人肺上皮细胞上表达[45]。病毒lincRNA(VIN)可以被流感病毒株(H1N1、H3N4、H7N7)和VSV所介导，但B型流感病毒却没有这种能力。VIN缺失功能分析揭露了VIN可以帮助流感病毒复制和病毒蛋白合成，在病毒的繁殖传播和毒力上起了很大作用。结论是，病毒可以在生物进化中通过多种机制绑架lncRNA为自身的复制和抑制机体抗病毒反应提供便利。对于HIV/AIDS至今还没有有效的治疗药物。HIV合成肽(p9)活化人HLA-A2型血单核细胞产生NTT，这是第一个被报道在细胞免疫中存在的内源性非编码RNA分子[46]。NEAT1是第一个被鉴定出的涉及HIV-1复制的lncRNA，NEAT1的表达可以上调HIV-1感染，但通过减少Rev依赖的不稳定元件(INS)由核到质的输出，可以在转录后抑制病毒复制[47]。NRON可以减少HIV-1感染，早期病毒附属蛋白Nef使NRON表达减少，晚期蛋白Vpu使NRON表达增加。但是HIV-1感染后NRON在细胞内显著减少，这是通过增加NFAT活性和病毒LTR增强了HIV-1复制[48]。lncRNA被证明在许多感染性疾病中发挥作用，宿主对EV71感染应答涉及超过4 800种lncRNA的表达[49]。HULC基因变体lncRNA增加中国人群对HBV相关肝细胞癌的危险性[50]。和健康人相比，在结核感染潜伏期组有449种lncRNA是失控的，1 113种lncRNA在结核活动期组是失调的，有163种lncRNA在结核感染潜伏期和结核活动期组表达有差异。这都成为了潜在的抗感染药物的靶标[51]。

4.2 病原体派生的lncRNA和宿主 一方面宿主可以编码lncRNA，另一方面病原体自身也可以产生lncRNA，这被认为在病原体生命周期和病原体与宿主的相互作用中都很重要。我们注意到病原体基因和这些基因产物与宿主基因产物相互作用而导致疾病，并对疫苗和抗感染药物产生了很大干扰。例如，HIV编码的反义lncRNA可以通过表观遗传途径(Dnmt3a、HDAC1和EZH2)与内源RNA直接作用抑制病毒转录[52]。巨细胞病毒是一种普遍存在的疱疹病毒，它可以在腺上皮细胞中持续复制，最终导致终身性潜伏感染。人巨细胞病毒表达一个5 kb长的稳定的内含子lncRNA(RNA5.0)[53]。但是，它不能在培养的成纤维细胞中稳定复制。大鼠巨细胞病毒(MCMV)表达一个7.2 kb长的同源体lncRNA(RNA7.2)，它对于病毒在唾液腺中持续表达有重要意义[54]。虽然MCMV RNA7.2的功能还不清楚，但是它在病毒存活和导致宿主持续感染中发挥了关键作用[55]。PAN(多聚腺苷酸核RNA)长1.2 kb，是1996年发现的由卡波西肉瘤病毒编码的(KSHV)lncRNA[56]。它可以减少IFN、IL-18、IFN-α-16和RNaseL的表达，这强有力地证明了PAN能作为免疫调控分子调节病毒和细胞蛋白相互作用[57,58]。PAN通过抑制KSHV基因组的表观遗传，在去甲基化酶UTX和JMJD3的协助下激活病毒复制，这一作用需要PAN连接到蛋白多聚梳子蛋白抑制复合物2(PRC2)上发挥作用[59，60]。PAN表达缺失后，KSHV转录过程受到抑制，PAN作为一个开关，控制着潜伏感染到溶解性感染的转换，以及增强疾病表型和病毒存活反应方面发挥作用[61]。ASP-L是从HIV DNA3′LTR U3区和env区转录出来的反义RNA，被命名为ASP RNA长变体(ASP-L),它有两种变体(ASP-L1和ASP-L2)[62]。ASP-L定位在细胞核，长2.6 kb，有抑制HIV-1复制的功能。敲除ASP-L后导致HIV-1表达增加。这个lncRNA可以指导表观遗传修饰(DNMT3和HDAC1减少)，敲除后可以导致位于HIV启动子的组蛋白沉默丢失。sfRNA(亚基因黄病毒RNA)是一个长0.5 kb起始于黄病毒RNA基因组3′非翻译区的lncRNA，对病毒致病性起关键作用。黄病毒是一组单链正义RNA病毒，包括黄热病、登革热病毒和西尼罗河病毒。sfRNA通过宿主5′～3′核酸外切酶XRN1引起病毒基因不完全降解[63]。从病毒基因组出来的sfRNA在3′非翻译区形成一个强大的环状结构，使得对核酸外切酶XRN1产生抵抗[64]。在日本脑炎病毒中也发现了sfRNA，它对抗基因组合成进行了调节从而阻止了JEV的翻译[65]。sfRNA的产生有助于增加病毒的致病性，但相关机制还不清楚。sfRNA展现出破坏宿主细胞Ⅰ型干扰素应答的能力，但机制不明。

5 总结和展望

我们现在对于lncRNA在免疫系统中的调节作用还知之甚少。lncRNA是细胞完整的组件，可以通过编码基因转录出有功能的非编码RNA。虽然大量的研究提示lncRNA在调节基因活化、蛋白表达、剂量补偿、基因印记、mRNA加工和细胞发育中发挥了关键作用，但其确切的功能和机制还需要充分研究。lncRNA通过顺式作用、反式作用和转录因子、染色质修饰、染色质重塑等过程，影响了基因表达的激活和抑制。人类的许多疾病与lncRNA发生故障有关，包括癌症、感染、神经系统疾病、免疫紊乱。我们应该认识到lncRNA对人类疾病的致病机理和结局以及预防和控制疾病的治疗方面将产生深远的影响。lncRNA在免疫系统的功能和表达会为人们分析免疫调控机制提供巨大的帮助，其中还有许多谜团未被揭开。例如，lncRNA的进化是否保守，它们并没有严格表现出和动物的同源性。为了解决这些问题，未来的研究需要聚焦在lncRNA的生物学作用以及它在动物体内的相关功能和临床转化上。虽然lncRNA不编码蛋白质，但是它可以在不同的组织和物种中编码一些小肽，这些小肽对于基因的调节也有待研究。通过RNA-seq和ChIRP-MS这类高通量技术，未来将更加明确lncRNA是怎样在生理或病理生理条件下调节多样的生物学过程的。随着lncRNA领域的快速深入研究，以lncRNA为基础的治疗将为消除人类疾病带来希望，这其中也包括免疫紊乱和免疫相关疾病。

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[收稿2016-01-27 修回2016-03-09]

(编辑 张晓舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.035

安志远(1985年-)，男，初级技师，主要从事微生物和免疫学方面研究，E-mail：mran850712@aliyun.com。

R392.9

A

1000-484X(2016)12-1878-07