巨自噬及分子伴侣介导自噬在类风湿关节炎中的相互作用及其联系①

孙英焕　吴　茜　李春莳　李林静　李光迪

(兰州大学第二医院检验中心，兰州730000)



巨自噬及分子伴侣介导自噬在类风湿关节炎中的相互作用及其联系①

孙英焕吴茜李春莳李林静李光迪

(兰州大学第二医院检验中心，兰州730000)

1　自噬的概述

自噬又称为“自我吞噬”(Self-eating)，是进化保守的细胞内溶酶体分解代谢过程，在细胞的生存、变异、发育及维持内环境稳态中发挥着必不可少的作用。细胞降解细胞质成分并回收利用营养素，同时自噬也参与固有免疫，与淋巴细胞的发育、形成和增殖有关[1]。研究发现自噬与自身免疫性疾病、肿瘤、代谢异常、氧化应激等病理过程密切相关。根据细胞内物质转运到溶酶体的方式不同，在哺乳动物细胞中分为三类：巨自噬(Macro-autophagy)、微自噬(Microautophgy)、分子伴侣介导自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)。细胞可通过不同的自噬途径清除错误折叠、受损的蛋白质，为细胞的再循环提供必需原料。尽管不同的自噬途径有其独特的性状并可在特定状况下被激活，但近期研究表明，不同的自噬途径之间相互联系、互为补充[2]。

2　巨自噬在类风湿关节炎发病机制中的作用

2.1巨自噬及其过程巨自噬由内质网来源的双层膜结构包裹细胞质中的可溶性蛋白和细胞器形成自噬泡，并携带进入溶酶体内形成自噬溶酶体后被水解酶降解，为细胞的再生修复提供原料[3]。它存在于从酵母到哺乳动物的所有真核生物中，是目前研究最为深入的一种自噬途径。其过程如下：首先在生存压力下(缺血缺氧、氧化应激、肿瘤、感染)等作用条件下，胞浆内形成内质网来源的独特双层膜结构，膜结构不断向周边延伸成扁平状，称之为自噬前体(Phagophore)，自噬前体的形成是发生自噬的标志性改变之一；随后，自噬前体不断延伸，逐渐包绕胞浆内某些正常或异常的营养物质及细胞器，形成封闭的球体结构，即自噬体(Autophagosome)；最后，自噬体通过细胞骨架被运送至溶酶体，与溶酶体融合形成自噬溶酶体(Autolysosome)后被水解酶降解，此途径最终通过通透酶的作用将氨基酸、糖类和脂质转运到胞液中二次利用[4]。

2.2巨自噬的调控

2.2.1PI3K/Akt/mTOR信号通路机体内存在多种巨自噬信号调控通路，目前研究最为深入的是PI3K/Akt/mTOR信号通路。该信号通路可参与体内不同生理病理过程，被激活后可对细胞自噬产生抑制作用。磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Phosphatidylin-ositol 3-kinase ，PI3K)活化后可催化磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)在D3位的磷酸化，形成三磷酸磷脂酰肌醇[Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate，PIP3]。该物质可进一步与细胞内含有PH结构域的信号蛋白AKT(蛋白酶)和磷脂酰肌醇依赖(Phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)结合,促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser308，导致AKT活化，将信号下传至雷帕霉素靶蛋白(mamma-lian target of rapamycin，mTOR)[5,6]，进一步磷酸化Atg13，抑制Atg1与Atg13、Atg17的结合，导致自噬体的形成受阻。mTOR作为自噬诱导剂可通过抑制上述途径促进自噬发生[7]。

研究表明Ⅲ型PI3K(Vesicular proteinsorting 34，Vps34)是调控PI3K通路上的关键物质，可与PI3K以PI为底物获得PI3P[8]。但此过程需要Beclin1蛋白的参与，形成Vps34-Vps15-Beclin1复合体。自噬发生时Vps34-Vps15-Beclin1和多种自噬相关蛋白结合，促进自噬发生[9]。

2.2.2Beclin1信号通路Beclin1蛋白是巨自噬的特异性蛋白，为抑癌基因，属于Bcl-2家族。为酵母ATG6 的同源物,大部分位于内质网中，定位于人类染色体 17q21[10]。其结构中有一个在进化中高度保守的结构域被命名为Beclin1ECD，是自噬诱导过程中的必需结构域[11]。与ClassⅢPI3K形成复合物(Vps34-Vps15-Beclin1)而参与自噬体膜的形成，并有引导其他自噬相关蛋白在自噬体膜上定位、促进自噬溶酶体形成的作用[12]。应用RNA干扰Beclin-1表达可以明显降低LC3Ⅱ的生成，抑制自噬体形成[13]。LC3蛋白又称微管相关蛋白轻链3(microtu-bule-associated protein 1 light chain 3,LC3)，为酵母ATG8 基因的同源物。在哺乳动物中分Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型经泛素样修饰后与磷脂酰乙醇胺结合,形成LC3Ⅱ在溶酶体中降解。LC3Ⅱ定位于自噬体膜,其形成依赖于Atg12-Atg5复合物[14]。

2.3巨自噬在类风湿关节炎中的作用RA是一种自身免疫性疾病，病理特点为关节滑膜病变导致慢性滑膜损伤和血管翳形成，血管翳又称绒毛，是造成关节破坏的基础。在显微镜下观察大部分由巨噬细胞样滑膜细胞(Macrophage-like synoviocytes)和成纤维样滑膜细胞 (Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASF)组成。Wu等[15]研究发现，PI3K/Akt/mTOR信号通路对RA滑膜细胞增殖有重要作用。Xu等[16]研究表明，用转染Beclin siRNA 抑制自噬途径，RASF较骨关节炎滑膜成纤维细胞(Osteoarthritis synovialfibroblasts，OASF)中Beclin1和LC3的表达水平明显升高，而国内在外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中的研究结果与其相反，其机制尚不明确[17]。抗环瓜氨酸抗体(Anticyclic citrullinated peptide antibody，Anti-CCP)具有较高的敏感性而作为RA的血清标志物之一广泛应用于临床，Ireland等[18]研究发现自噬抑制剂3-甲级腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)或Atg5表达水平与抗CCP抗体水平呈正相关。

3　CMA在类风湿关节炎发病机制中的作用

3.1概述及过程 CMA仅存在于哺乳动物的不同细胞类型中，如纤维母细胞、肝细胞、星型胶质细胞、巨细胞以及一系列的癌症细胞等[4]。与其他两种自噬过程的本质区别在于其不形成自噬囊泡，而是通过独有的溶质蛋白转运至溶酶体然后进行降解[19]。Rajawat等[20]研究发现，随着年龄的不断增加，衰老可能会影响溶酶体相关膜蛋白(Lysosomeassociated membrane protein type 2a，LAMP-2a)与底物蛋白的的结合，说明CMA可以维持内环境稳态。CMA被认为是一种具有高度选择性的降解过程，热休克蛋白70(Heat shock cognate chaperone of 70，Hsc70)在CMA途径中发挥重要作用。Hsc70联合其他的分子伴侣(Hsp40、Hsp90、hip、bag-1等)识别特定的目标降解蛋白携带的五肽相关序列KFERQ与底物蛋白结合形成分子伴侣-底物复合物到达溶酶体膜，与溶酶体膜受体LAMP-2a结合。这些底物蛋白可以转运至溶酶体腔被迅速降解并在细胞内重新循环利用，主要是依赖溶酶体Hsc70(Ly-Hsc70)，并不涉及溶酶体膜的变形。此过程主要包括两个蛋白复合体即底物所识别的分子伴侣复合体和LAMP-2a跨膜复合体[4，21]。

3.1.1底物所识别的分子伴侣复合体Hsc70位于hspa8编码的11号染色体上。可促进蛋白折叠或装配，还可以通过囊泡参与网格蛋白的分离和蛋白的重组，除此以外，也可通过内质网和线粒体的转位合成新的蛋白质。KFERQ与细胞质内的Hsc70及其分子伴侣复合物结合并帮助其穿过溶酶体膜进入溶酶体腔，Hsc70与底物的结合受ATP酶和水解酶的调控，其中前者占主导地位。Hsc70既存在于细胞质中，同时Ly-Hsc70也是CMA所必需的转运底物并起决定性作用。Ly-Hsc70相当于细胞质中Hsc70的酸性同种型，具有相同的等电点。用中和抗体通过内吞作用首先阻断成纤维细胞中的Ly-Hsc70，CMA将会受阻，而阻断Hsc70对CMA无影响。Hsc70既是底物，也与CMA受体具有交互作用，但目前我们尚不清楚在转运到溶酶体腔前有多少Hsc70发挥作用[22-26]。同时，不同的研究者研究的对象不同。有些研究者侧重于细胞内Hsc70，而有些则着重于溶酶体腔中的Hsc70。

3.1.2LAMP-2a跨膜复合体LAMP2是一跨膜溶酶体糖蛋白，可维持溶酶体的完整性。经过可变剪接后分三个亚型，LAMP-2a、LAMP-2b和LAMP-2c。它们具有相同的高氮端糖基化。用RNAi抑制小鼠成纤维细胞中的LAMP2同源多聚体证实只有LAMP-2a参与CMA，而LAMP-2b可能在巨自噬中发挥作用。LAMP-2c的作用尚不明确[27]。溶酶体膜上的受体LAMP-2a与Ly-Hsc70结合是CMA的关键步骤，而LAMP-2a是此过程的关键蛋白[28]。Kiffin等[29]研究表明轻微的氧化刺激可以通过CMA途径使氧化蛋白降解，LAMP-2a高表达。

3.2分子伴侣介导自噬在类风湿关节炎中的作用Schick等[22]在正常人和RA患者的滑膜组织中研究发现Hsc70高表达，其上调机制可能与抗原加工提呈有关。同时有研究发现CMA在主要组织相容性复合体Ⅱ类复合物(Major histocompatibility complex class Ⅱ-mediated，MHC Ⅱ)抗原加工提呈过程中发挥关键作用，而免疫紊乱是RA发病的主要机制[30]。LAMP-2a与RA的关系迄今为止国内外未见报道。Cacciottolo等[21]研究表明在包涵体肌炎患者中LAMP-2a和Hsc70高表达。另有研究表明[31]，氧化应激状态下体内活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平增加，伴随自由基清除剂超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase ，SOD)低表达。ROS 不仅参与细胞的增殖、分化及凋亡等生理过程，还可以激活自噬。氧化应激是RA发生的一个重要因素，RA患者在过氧化能力增强的同时，抗氧化能力会减弱。RA患者的外周血和滑膜液中高表达ROS和活性氧产生的分子[32]。CMA也被称为是一种应激途径，曹丽丽等[33]研究发现氧化应激时，LAMP-2a、ROS高表达，SOD低表达，这都提示氧化应激可能可通过调节CMA参与RA的发病，但机制尚不明确。

4　巨自噬与CMA的联系

在生理学和病理学条件下，巨自噬与CMA作为两种重要的自噬途径在细胞内蛋白质的转换和再利用过程中发挥着决定性作用[4]。尽管两者在细胞内的发生机制不同，但研究显示两者存在一定的联系。可能是因为在巨自噬和CMA交互过程中，持续的巨自噬活性增强导致溶酶体腔内pH值暂时增高，从而降低Ly-Hsc70的稳定性并使之失活，最终导致一过性的CMA的活性降低[34]。在营养匮乏早期，巨自噬途径被激活产生必需氨基酸，随着时间的延长，CMA将会取代巨自噬途径，降解非必需蛋白从而获得氨基酸，维持细胞的生存。说明CMA与巨自噬存在代偿关系[35]。巨自噬的这种分子补偿机制可能是因为CMA的损伤，而具体机制不明确，但已被证明CMA阻断的早期通过RNA干扰LAMP-2a，巨自噬活性降低是由于增加了mTOR活性，而长时间阻断CMA将导致细胞内Beclin 1高表达,减少mTOR的磷酸化[4]。唐莎[36]研究发现ANAC相关性血管炎中LAMP-2a抗体可以使Beclin1和LC3高表达。Wu等[4]对53名帕金森综合征患者的PBMCs研究中发现当阻断CMA时巨自噬途径将会上调。在那么在RA中上述联系是否存在又是如何发挥作用的，目前尚见文献报道。

5　展望

综上所述，随着人们对巨自噬和CMA研究机制不断深入，我们发现两者在RA的发病机制与疾病的发展存在一定的关系。但通过何种途径造成RA发病以及如何加剧病程进展的机制目前我们尚不清楚，这需要更深入的研究，寻找早期诊断RA的分子标志物以及有效的药物治疗靶点，减少RA患者致残率，提高患者的生活质量。

[1]Pierdominici M,Vomero M,Barbati C,etal.Role of autophagy in immunity and autoimmunity,with a special focus on systemic lupus erythematosus[J].FASEB J,2012,26(4):1400-1412.

[2]Bandhyopadhyay U,Cuervo AM.Chaperone-mediated autophagy in aging and neurodegeneration:Lessons from α-synuclein[J].Experimental gerontol,2007,42(1):120-128.

[3]Levine B,Klionsky DJ.Development by self-digestion:molecular mechanisms and biological functions of autophagy[J].Developmental cell,2004,6(4):463-477.

[4]Wu H,Chen S,Ammar AB,etal.Crosstalk between macroautophagy and chaperone-mediated autophagy:implications for the treatment of neurological diseases[J].Molecular neurobiol,2015,52(3):1284-1296.

[5]Sun H,Wang Z,Sebastian YJ.Natural products targeting autophagy via the PI3K/Akt/mTOR pathway as anticancer agents[J].Anti-Cancer Agents Med Chem,2012,13(7):1048-1056.

[6]Assinder SJ,Dong Q,Kovacevic Z,etal.The TGF-beta,PI3K/Akt and PTEN pathways:established and proposed biochemical integration in prostate cancer[J].Biochemical J,2009,417(2):411-421.

[7]Jung CH,Ro SH,Cao J,etal.mTOR regulation of autophagy[J].FEBS Letters,2010,584(7):1287-1295.

[8]Glick D,Barth S,Macleod KF.Autophagy:cellular and molecular mechanisms[J].J Pathol,2010,221(1):3-12.

[9]He C,Levine B.The beclin 1 interactome[J].Curr Opin Cell Biol,2010,22(2):140-149.

[10]Gozuacik D,Kimchi A.Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism[J].Oncogene,2004,23(16):2891-2906.

[11]Huang W,Choi W,Hu W,etal.Crystal structure and biochemical analyses reveal Beclin 1 as a novel membrane binding protein[J].Cell Res,2012,22(3):473-489.

[12]Kuma A,Mizushima N.Physiological role of autophagy as an intracellular recycling system:with an emphasis on nutrient metabolism[J].Semin Cell Dev Biol,2010,21 (7):683-690.

[13]Xing S,Zhang Y,Li J,etal.Beclin 1 knockdown inhibits autophagic activation and prevents the secondary neurodegenerative damage in the ipsilateral thalamus following focal cerebral infarction[J].Autophagy,2012,8(1):63-76.

[14]Gozuacik D,Kimchi A.Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism[J].Oncogene,2004,23(16):2891-2906.

[15]Wu T,Mohan C.The AKT axis as a therapeutic target in autoimmune diseases[J].Endocrine,Metabolic Immune Disorders-Drug Targets ,2009,9(2):145-150.

[16]Xu K,Xu P,Yao J F,etal.Reduced apoptosis correlates with enhanced autophagy in synovial tissues of rheumatoid arthritis[J].Inflammation Research,2013,62(2):229-237.

[17]洪永桃，刘静，邹倩.自噬在类风湿关节炎和系统性红斑狼疮中的作用[J].风湿病与关节炎，2014,36(6)：49-52.

[18]Ireland JM,Unanue ER.Autophagy in antigen-presenting cells results in presentation of citrullinated peptides to CD4 T cells[J].J Experimental Med,2011,208(13):2625-2632.

[19]Patel B,Cuervo AM.Methods to study chaperone-mediated autophagy[J].Methods,2015,75:133-140.

[20]Rajawat YS,Hilioti Z,Bossis I.Aging:central role for autophagy and the lysosomal degradative system[J].Ageing Res Rev,2009,8(3):199-213.

[21]Cacciottolo M,Nogalska A,D′Agostino C,etal.Chaperone-mediated autophagy components are upregulated in sporadic inclusion-body myositis muscle fibres[J].Neuropathol applied neurobiol,2013,39(7):750-761.

[22] Schick C,Arbogast M,Lowka K,etal.Continuous enhanced expression of Hsc70 but not Hsp70 in rheumatoid arthritis synovial tissue[J].Arthritis Rheum,2004,50(1):88-93.

[23]Kaushik S,Cuervo AM.Autophagy as a cell-repair mechanism:activation of chaperone-mediated autophagy during oxidative stress[J].Mol Aspects Med,2006,27(5-6):444-454.

[24]Koga H，Cuervo AM.Chaperone-mediated autophagy dysfunction in the pathogenesis of neurodegeneration[J].Neurobiol Disease,2011,43(1):29-37.

[25]Agarraberes FA,Terlecky SR,Dice JF.An intralysosomal hsp70 is required for a selective pathway of lysosomal protein degradation[J].J Cell Biol,1997,137(4):825-834.

[26]Majeski AE,Dice JF.Mechanisms of chaperone-mediated autophagy[J].Int J Biochemistry Cell Biol,2004,12(36):2435-2444.

[27]Massey AC,Kaushik S,Sovak G,etal.Consequences of the selective blockage of chaperone-mediated autophagy[J].Proc Nat Acad Sci USA,2006,103(15):5805-5810.

[28]Rothaug M,Stroobants S,Schweizer M,etal.LAMP-2 deficiency leads to hippocampal dysfunction but normal clearance of neuronal substrates of chaperone-mediated autophagy in a mouse model for Danon disease[J].Acta Neuropathol Commun,2015,1(3):1-17.

[29]Kiffin R,Christian C,Knecht E,etal.Activation of chaperone-mediated autophagy during oxidative stress[J].Molecular Biol Cell,2004,15(11):4829-4840.

[30]Wang F,Muller S.Manipulating autophagic processes in autoimmune diseases:a special focus on modulating chaperone-mediated autophagy,an emerging therapeutic target[J].Front Immunol,2015,6:252.

[31]Levine B,Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease[J].Cell,2008,132(1):27-42.

[32]Ishibashi T.Molecular hydrogen:new antioxidant and anti-inflamiflammatory therapy for rheumatioid arthritis and related diseases [J].Curr Pharm Des,2013,19(35):6375-6381.

[33]曹丽丽,迟令懿,张同霞,等.抗坏血酸对癫痫大鼠海马分子伴侣介导的自噬激活的影响[J].中国病理生理杂志,2012,28(6):1140-1143.

[34]Cuervo AM,Dice JF,Knecht EA.Population of rat liver lysosomes responsible for the selective uptake and degradation of cytosolic proteins[J].J Biological Chemistry,1997,272(9):5606-5615.

[35]Cuervo AM.Chaperone-mediated autophagy:selectivity pays off [J].Trends Endocrinol Metab,2010,21(3):142-150.

[36]唐莎,张静波.ANCA 相关性血管炎的免疫发病机制新进展[J].免疫学杂志,2013,29(7):628-631.

[收稿2015-12-30修回2016-03-16]

(编辑许四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.035

孙英焕(1990年-), 女，在读硕士，主要从事自身免疫性疾病研究，E-mail:494062307@qq.com。

及指导教师：李光迪(1960年-)，男，硕士生导师，主要从事自身免疫性疾病的研究工作，E-mail: guangdi843133@163.com。

R593.22

A

1000-484X(2016)10-1566-04

①本文为兰州市科技计划项目(2014-1-35)。