垂体腺瘤与DNA甲基化的研究进展

位振清，李　阳，李伟华，娄佳成，张　波

1大连医科大学　第一临床医学院神经外科，辽宁大连 1160112大连医科大学　第二临床医学院神经外科，辽宁大连 116000



·综述·

垂体腺瘤与DNA甲基化的研究进展

位振清1，李阳1，李伟华1，娄佳成2，张波2

1大连医科大学第一临床医学院神经外科，辽宁大连 1160112大连医科大学第二临床医学院神经外科，辽宁大连 116000

DNA甲基化与垂体腺瘤的发生发展密切相关。有研究表明钾电压程控通道β2成员、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶、棘皮动物微管相关蛋白、ras同族成员D、同源盒基因B1、NNAT和P16启动子区域的高甲基化抑制基因的转录表达，从而调控垂体腺瘤的增殖；DNA甲基化与侵袭性垂体腺瘤密切相关。因此，深入研究垂体腺瘤DNA甲基化的分子机制，将为垂体腺瘤的诊治提供一个新的策略。

DNA甲基化；垂体腺瘤；诊断；治疗

ActaAcadMedSin，2016,38(4)：475-479

垂体腺瘤是人类常见的颅内良性肿瘤，占颅内肿瘤的15%～25%。临床上经常见到有些垂体腺瘤呈侵袭性生长，侵犯鞍区周围，侵入海绵窦包绕颈内动脉等。这些肿瘤手术不易全切，术后易复发，药物和放射治疗也不能令人满意，称之为侵袭性垂体腺瘤，其治疗一直是神经外科的一个挑战[1]。只有对其分子机制进行深入的研究，进行靶向药物开发，才能彻底战胜该肿瘤。目前，CpG岛异常高甲基化所致抑癌基因转录失活以及整个基因组异常低甲基化所致原癌基因的激活，已经成为肿瘤研究中的热点问题。本文主要综述DNA甲基化与垂体腺瘤的研究进展。

DNA甲基化

概述DNA甲基化是表观遗传学研究的主要内容之一。在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基基团，通常发生在5’胞嘧啶位置上，具有调节基因表达和保护DNA位点不受特定限制酶降解的作用。在人类基因组中存在着一些长度为300～3000 bp富含CpG二核苷酸的区域，主要存在于基因的5’区域，这些结构被称为CpG岛。正常状态下，CpG岛的未甲基化状态是基因转录所必需的，而其异常甲基化可导致基因转录受抑制。大约40%哺乳动物的CpG岛延伸至DNA的启动子区域，使转录因子沉默，并且这种特性可以稳定遗传，明显抑制基因的表达作用[2]。

DNA甲基化与肿瘤传统观点认为肿瘤发生的主要机制是各种致癌因素造成DNA序列变异，从而导致细胞生长分化失控，最终导致肿瘤的形成。近年来，随着研究的深入，人们发现DNA序列以外的调控机制异常在肿瘤的发生、发展过程中更为普遍，这种调控机制称为表观遗传学机制，该机制是与DNA突变无关的可遗传的表型变化[3]，其中DNA甲基化是表观遗传学研究最为深入的一种机制。启动子区高甲基化导致的基因沉默是一个可以逆转的过程，因此，抑制DNA甲基化，使已发生甲基化的基因去甲基化，从而激活失活的基因，可作为肿瘤治疗的新靶点[4]。目前，参与DNA修复、细胞分化和凋亡、调节细胞周期、耐药性及肿瘤侵袭转移的基因已被鉴定出在不同的肿瘤中较易出现高甲基化。

垂体腺瘤的异常DNA甲基化

垂体腺瘤研究的主要方向研究表明许多肿瘤细胞中都存在着DNA甲基化方式的显著改变[5]，其发生发展与DNA甲基化模式密切相关，肿瘤DNA常呈现出基因特异性的CpG岛高甲基化，抑制了基因的转录表达，是肿瘤抑制基因失活的重要途径[6]。DNA的甲基化与垂体腺瘤也密切相关。Newey等[7]对7个无功能垂体腺瘤做外显子测序，未发现明显有意义的基因变异，其推测无功能垂体腺瘤的发生发展可能与表观遗传有关，如DNA的甲基化等。Fukuoka和Takahashi[8]分析总结基因和表观遗传在垂体腺瘤发生过程中的作用，其推测表观遗传如DNA甲基化、miRNA和非编码RNA等在垂体腺瘤的发生发展中有更重要的作用。Farrell[9]指出：全基因组学研究结果表明表观遗传变异在垂体腺瘤中很常见，是今后垂体腺瘤研究的主要方向。其中DNA甲基化、miRNA等抑制基因表达，与肿瘤细胞增殖相关，而且应用相应靶向药物(如去甲基化)，可使基因重新表达。

垂体腺瘤DNA甲基化的研究进展近几年，许多学者都在做垂体腺瘤的甲基化研究。

KCNAB2：Ling 等[10]根据Knosp分级情况，将24例不同病理类型的垂体腺瘤分成两组，进行甲基化芯片检测和RNA测序，结果分析显示无功能型较功能型垂体腺瘤呈现明显的高甲基化，其中钾离子电控通道基因KCNAB2启动子区域的高甲基化，抑制下游离子通道蛋白的表达，这可能与无功能垂体腺瘤的激素分泌不活跃相关。由此，DNA甲基化的分析结果或许可以补充目前垂体腺瘤的分子病理分型标准，对于研究无功能垂体腺瘤的发生发展有指导意义。

端粒酶逆转录酶：端粒酶逆转录酶的异常表达是肿瘤发生的一个显著特点，垂体腺瘤中基因变异少见，而甲基化很常见。Köchling等[11]通过特定的甲基化聚合酶链反应测定85例初发和15例复发垂体腺瘤端粒酶逆转录酶启动子区域甲基化情况，发现端粒酶逆转录酶启动子区域的甲基化很稳定，与肿瘤亚型、大小、激素水平等无关联，对判断预后也无价值。

O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶：Arya 等[12]取30例垂体腺瘤患者的肿瘤组织，测定O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O- 6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)启动子区域的甲基化情况，并做E3泛素蛋白连接酶1、p53和MGMT的免疫组织化学，其中40%的肿瘤有甲基化，甲基化肿瘤中MGMT蛋白表达的只有41.6%，而未甲基化MGMT蛋白表达的高达72.2%，未甲基化的患者术后肿瘤再生长率显著增高，表明MGMT的甲基化与肿瘤的增殖密切相关。

CDKN2A：Pease等[13]认为表观遗传学在垂体腺瘤的发生发展中发挥关键作用，对其诊断和治疗有指导作用，因此，其回顾了1993至2013年关于垂体腺瘤与表观遗传学的文献，证据表明：有24个基因与表观遗传密切相关，其中16个是通过DNA甲基化抑制表达的，5个基因细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A、生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45y、成纤维生长因子受体2、半胱氨酸蛋白酶8和菱形区域基因3在垂体腺瘤组织中DNA异常甲基化高达50%以上，其中CDKN2A与肿瘤侵袭和组织病理亚型相关。

EML2、RHOD 和 HOXB1：Duong等[14]收集一组垂体腺瘤，包括无功能、泌乳素、生长激素和促肾上腺皮质激素各型，在肿瘤全基因组内高通量检测(超过14 000个基因，包括27 578个CpG位点)DNA甲基化，通过焦磷酸测序进一步验证筛选出12个基因，有3个基因EML2、RHOD 和HOXB1表现为甲基化和转录组表达负相关，即启动子出现高甲基化，而基因表达明显降低。13例无功能型中12例刺猬互动蛋白1和转录因子AP- 2E呈现明显高甲基化。这类研究对于探索预测肿瘤生长的生物标记物和病因有重要意义，为进一步诊断和靶向治疗提供了新的途径。

印记基因NNAT：印记基因NNAT属于肿瘤抑制基因，是垂体中最常见的转录基因之一，与垂体的生长发育及成熟密切相关。正常垂体的免疫组织化学定位显示各种分泌细胞(如泌乳素、生长激素、促肾上腺皮质激素、卵泡刺激素和促甲状腺激素)都表达NNAT。Revill等[15]取47例垂体腺瘤组织(包括11例生长激素型、10例泌乳素型、12例促肾上腺皮质激素型和14例无功能型)，分别作实时定量-PCR和免疫组织化学，其中33例中NNAT转录体和蛋白均未表达，检测其启动子CpG区发现存在明显的高甲基化。这些发现表明NNAT的高甲基化在垂体肿瘤的发生发展中发挥重要作用。

P16：P16是编码细胞周期蛋白依赖性激酶4的抑制蛋白，通过抑制RB转录辅抑制物1的磷酸化作用，控制细胞进入G1-S增殖周期，其功能减弱在很多肿瘤发生发展中发挥重要作用。研究表明，在大多数人类垂体腺瘤中，P16表达丧失与其突变、纯合性缺失无关，而与该基因CpG岛完全被甲基化有关[16- 17]。WoloSchak等[16]研究显示，20个垂体腺瘤中18个出现CpG岛区异常甲基化，3个垂体腺瘤的外显子2的HpaⅡ位点有甲基化，Western blot分析表明垂体腺瘤的P16蛋白表达缺失。Simpson[17]研究了大样本的无功能垂体腺瘤，甲基化敏感限酶消化后PCR扩增的结果表明，70%无功能腺瘤P16基因内的CpG岛出现甲基化，其还用免疫组织化学技术评估P16蛋白的表达，发现78%的甲基化肿瘤未能表达P16蛋白，提示异常甲基化与P16蛋白表达明显相关，与垂体腺瘤的发生发展密切相关。

侵袭性垂体腺瘤的DNA甲基化研究侵袭性垂体腺瘤中视网膜母细胞瘤蛋白的表达降低，研究表明：PRb蛋白丧失与RB1基因内标志物的杂合性丢失无关，而与RB1启动子区域甲基化有关[18]。其他一些与垂体腺瘤侵袭性相关的肿瘤抑制基因P53和nm23也做了转录表达和蛋白水平的研究，结果发现与侵袭行为有关的一些变化，在遗传学上也无异常改变[18]。DNA异常甲基化也是死亡相关蛋白激酶失活的重要表观遗传学机制，而它的表达与垂体腺瘤的侵袭性生长存在着明显负相关[19]。如DNA损伤的修复蛋白MGMT在侵袭性垂体瘤中的表达明显降低，造成其表达下降的原因就是其启动子的高甲基化。MGMT的甲基化不但可以作为肿瘤诊断的生物标记，它还影响了肿瘤的生物学行为以及对化疗的敏感性[20]。甲基化异常能使多种抑癌基因失活，它们的失活则会显著促进肿瘤的生长[21]。由此可见，甲基化异常是促进垂体腺瘤侵袭性生长的重要原因。因此，深入研究导致肿瘤异常甲基化的原因，不但有助于更加清晰地理解侵袭性垂体腺瘤的发病机制，还有助于发现新的治疗靶点。

DNA异常甲基化与垂体腺瘤的诊疗

诊断检测基因异常甲基化可用于肿瘤诊断，肿瘤细胞与正常细胞间基因组甲基化差异就是其理论基础。目前垂体腺瘤的诊断主要依靠磁共振影像和内分泌检查，基因异常甲基化对于垂体腺瘤的诊断和分型尚处于研究阶段，未广泛应用于临床。由于很多肿瘤患者血浆游离DNA明显升高，且具备肿瘤细胞生物学特性，支持了血浆中游离DNA大多来自原发肿瘤的判断[22- 23]，这点极具肿瘤早期诊断价值。

治疗肿瘤抑制基因异常甲基化是肿瘤表观遗传治疗靶点，其表达异常是可逆的，改变DNA的甲基化方式则可能影响肿瘤的生长[21]。CpG岛甲基化对去甲基化剂十分敏感，使用去甲基化剂不可能引起正常组织中有功能基因表达异常。实验室资料显示去甲基化治疗能明显抑制垂体瘤细胞的生长，这可能与甲基化方式改变后使得某些抑癌基因的功能恢复有关，应用甲基转移酶抑制剂可使这些基因重新去甲基化，从而抑制肿瘤；可使肿瘤细胞提高对传统治疗(如放化疗)的敏感性；可使多巴胺D2受体阴性和难治性垂体腺瘤恢复到受体阳性状态。去甲基化治疗与传统治疗方式(手术和放化疗)相结合，有希望彻底治愈垂体腺瘤[21]。目前去甲基化治疗尚未临床应用于垂体腺瘤。美国食品和药品管理局已经批准去甲基化方案进入部分血液病的临床治疗，该方案对白血病和骨髓异常增生综合征都具有显著的效果[24]。5-氮杂- 2’脱氧胞苷是去甲基化治疗肿瘤的代表性药物[25]，其作用机制是与DNA甲基转移酶共价结合，抑制其生物活性并改变基因甲基化状态。但这类药物无组织或基因特异性，并非所有高甲基化抑癌基因均可被其激活，故临床应用有限。近几年，有学者利用小干扰RNA靶向抑制DNA甲基转移酶1表达，发现可激活因异常甲基化而失活的抑癌基因，并显著抑制肿瘤[2]。DNA甲基化程度可以评估肿瘤的病理分级、分期，呈正相关趋势；DNA异常甲基化与肿瘤侵袭转移以及复发密切相关，从而影响肿瘤患者的生存期[26- 27]。

综上，DNA的甲基化异常和肿瘤的发生、发展有着密切的关系，同样与垂体腺瘤密切相关，甲基化方式异常是促进垂体腺瘤侵袭性生长的重要原因。因此，深入研究垂体腺瘤异常甲基化的原因，有助于探索垂体腺瘤的发病机制和建立垂体腺瘤的分子病理分型，也为侵袭性垂体腺瘤的诊治提供了一条新的途径。

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Research Advances in Pituitary Adenoma and DNA Methylation

WEI Zhen-qing1，LI Yang1，LI Wei-hua1，LOU Jia-cheng2，ZHANG Bo2

1Department of Neurosurgery，the First Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian，Liaoning 116011，China2Department of Neurosurgery，the Second Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian，Liaoning 116000，China

ZHANG BoTel：0411- 84671291- 5190，E-mail： zhangbodl@126.com

DNA methylation is closely related to the genesis and development of pituitary adenoma. Studies have shown that high methylation in the promoter region of potassium voltage-gated chanel，shaker related subfamily，beta member 2，O- 6-methylguanine-DNA methyltransferase，echinoderm microtubule associated protein like 2 ，ras homolog family member D ，homeobox B1 ，NNAT， and P16 inhibits the expression of these genes and regulates of the proliferation of pituitary adenoma. DNA methylation is also closely related to invasive pituitary adenoma. Therefore，further study on molecular mechanism of DNA methylation of pituitary adenoma will offer a new strategy for the diagnosis and treatment of pituitary adenoma.

DNA methylation；pituitary adenoma；diagnosis；treatment

国家自然科学基金(81372714)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81372714)

张波电话：0411- 84671291- 5190，电子邮件： zhangbodl@126.com

R651

A

1000- 503X(2016)04- 0475- 05

10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.04.019

2016- 03- 21)