黑木耳富硒发酵条件的优化

刘建荣，温秀荣，顾雅君

(1. 河北大学 生物技术研究中心，河北 保定　071002；2. 保定职业技术学院 农林与生物工程系，河北 保定　071051；

3. 河北大学 生命科学学院，河北 保定　071002)



黑木耳富硒发酵条件的优化

刘建荣1，温秀荣2，顾雅君3

(1. 河北大学 生物技术研究中心，河北 保定071002；2. 保定职业技术学院 农林与生物工程系，河北 保定071051；

3. 河北大学 生命科学学院，河北 保定071002)

摘要：为获得富硒黑木耳菌丝体，以亚硒酸钠为硒源对黑木耳(Auricularia auricular)高产菌株G6进行富硒发酵条件优化．以菌丝体性状和菌丝体硒含量为指标考查不同硒质量浓度对其生长的影响，并确定最适硒质量浓度；通过单因素和正交实验对G6菌株液体富硒发酵条件进行优化．结果，培养基中硒质量浓度<50 mg/L 时，菌丝体的硒含量随硒质量浓度的提高而提高；硒质量浓度为50 mg/L时，菌丝体硒含量最高，为8.5 μg/g；硒质量浓度>50 mg/L 时，硒含量不升反降.表明适量亚硒酸钠有利于菌丝体对硒的吸收和利用，过量添加时则抑制菌丝体生长，不利于菌丝体对硒的吸收和利用．优化后的富硒黑木耳G6菌株液体发酵培养条件为硒质量浓度50 mg/L，玉米粉15 mg/L ，豆饼粉20 mg/L，装液量200 mL/500 mL三角瓶，转速160 r/min，25 ℃发酵培养6 d．发酵液中菌丝体硒质量分数达到9.2 μg/g，发酵液多糖质量浓度可达3.7 g/L．

关键词：黑木耳；硒；多糖；发酵

Optimization of Se-enriched fermentation conditions

ofAuriculariaauricula

LIU Jianrong1，WEN Xiurong2，GU Yajun3

(1. Research Center of Biotechnology，Hebei University，Baoding 071002，China；2. Department of

Agriculture,Forestry and Bioengineering,Baoding Vocational College，Baoding 071051，China；

3. College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China)

第一作者：刘建荣(1963-)，女，河北保定人，河北大学副研究员，主要从事生化及微生物学研究．

黑木耳(Auriculariaauricula)是药食两用的优质大型食用真菌.黑木耳中的胶质体具有较强的吸附能力，可把残留在人体消化系统中的灰尘和杂质聚集起来，起到清除胃肠异物的作用，因此是从事采矿、纺织和化工生产等行业人员良好的保健食品．真菌多糖自20世纪60年代被发现具有抗肿瘤活性以来[1]，众多学者开展了对黑木耳多糖的研究，并证实其具有抗凝血、降血脂、抗衰老、增强机体免疫功能和抑制肿瘤等作用[2-3]．硒(Se)是人体正常生理活动所必需的一种微量元素，是体内抗氧化酶——谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的重要组成部分．人体的贫血、慢性类风湿性关节炎、肝硬化、大骨节病等多种疾病的发生，大多与人体内缺乏硒元素相关，且硒的缺乏还会增加罹患前列腺癌、皮肤癌、肺癌和结肠癌的风险[4-5]．然而硒常以无机盐态存在于自然界，不仅不利于人体吸收，而且含量还相当稀少和分散．目前世界各国都普遍存在着硒摄入不足的问题，严重威胁着人体健康．只依靠天然食品补硒很难从根本上改善人体缺硒状态．研究发现，黑木耳菌丝体具有很强的富硒能力[6]．菌丝体可将无机态硒转化为能被人体所吸收利用的有机态硒多糖和硒蛋白，并在细胞中富集．对肿瘤生长的抑制作用，黑木耳硒多糖优于黑木耳多糖[7]．因此，将食用菌和有机硒食于一体的天然营养保健食品的研究和开发已成为研究热点,但是鲜有对黑木耳进行液体富硒发酵的研究．本研究以亚硒酸钠为硒源，通过单因素和正交实验对筛选所得的黑木耳高产菌株进行液体富硒发酵条件的优化，以期获得优质富硒黑木耳菌丝体，从而为后续研制和开发富硒黑木耳食药制品提供实验依据．

1材料与方法

1.1　材料与仪器

1.1.1黑木耳菌株

黑木耳高产菌株G6，为本实验室自60个来自华北地区较优良的黑木耳栽培菌株中经筛选所得．

1.1.2CPDA培养基斜面

去皮马铃薯200 g，切碎，加适量水煮沸30 min，纱布过滤.于滤液中加入琼脂20 g，加热溶解后依次加葡萄糖20 g、磷酸二氢钾2 g和硫酸镁0.5 g，补水至1 L.分装试管，于121 ℃湿热灭菌20 min，取出并摆斜面，冷却后储存备用．

1.1.3液体富硒发酵培养基

每L培养基含有豆饼粉20 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾4 g，硫酸镁2 g，亚硒酸钠50 mg，VB 110 mg，自然pH．

1.1.4主要仪器

UV-1800 紫外可见分光光度计(天美有限公司)，荧光分光光度计 F96S(上海奥析科学仪器有限公司)，HWY-211B-旋转式摇床(上海智诚分析仪器有限公司)．

1.2　方法

1.2.1硒质量浓度对G6菌株生长的影响

在CPDA培养基中分别添加0，10，30，50，70，90 mg/L亚硒酸钠，常规接种黑木耳菌株G6，考察不同硒质量浓度下的各菌株菌丝形态和发菌时间，测定菌丝体中的硒含量，考察不同硒质量浓度对G6生长的影响，并确定富硒最适硒质量浓度．

1.2.2高产黑木耳G6菌株富硒发酵条件的优化

1.2.2.1生长时间对筛选确定的黑木耳高产菌株进行液体富硒摇瓶发酵条件的优化．用接种铲将已活化的斜面菌种分割为5 mm×5 mm的小菌块，接种于液体富硒发酵培养基中，装液量为200 mL/500 mL三角瓶，3组平行实验，于旋转式摇床(150 r/min)25 ℃下分别培养8 d，每天定时取样，分析不同生长时间对发酵液多糖含量和菌丝体硒含量的影响，以确定最优生长时间．

1.2.2.2碳源同1.2.2.1分别接种小菌块于4种不同碳源即蔗糖、葡萄糖、玉米粉、麦芽糖的富硒发酵培养基中(添加质量浓度均为20 g/L)，装液量均为200 mL/500 mL三角瓶，做3组平行实验，以上述实验确定的最优生长时间于旋转式摇床(150 r/min)25 ℃下培养，分析不同碳源对发酵液多糖含量和菌丝体硒含量的影响，以确定最优碳源．

1.2.2.3氮源分别接种小菌块于4种不同氮源即豆饼粉、蛋白胨、酵母膏、尿素的上述优化了碳源的富硒发酵培养基中(添加质量浓度均为20 g/L)，装液量200 mL/500 mL三角瓶，3组平行实验，以上述实验确定的最优碳源和生长时间于旋转式摇床(150 r/min)25 ℃下培养，分析不同氮源对发酵液多糖含量和菌丝体硒含量的影响，以确定最优氮源．

1.2.2.4转速分别接种小菌块于上述优化培养基中，装液量200 mL/500 mL三角瓶，3次平行实验，分别在100 ，130 ，160 ，190 r/min转速下，以上述实验确定的最优碳、氮源和生长时间于25 ℃进行摇床培养，分析不同转速对发酵液多糖含量和菌丝体硒含量的影响，以确定最优转速．

1.2.2.5装液量分别接种小菌块于上述优化培养基中，500 mL三角瓶中培养基的装液量分别为100，150 ，200 ，250 mL，做3组平行实验，按上述确定的最适条件于25 ℃进行摇床培养，分析不同装液量对发酵液多糖含量和菌丝体硒含量的影响，以确定最优装液量．

1.2.2.6正交实验为全面考察各因素及其相互作用对发酵液多糖含量和菌丝体硒含量的影响，在单因素实验的基础上，以碳源(A)、氮源(B)、转速(C)、生长时间(D)、装液量(E)为实验因素，以发酵液菌丝体硒含量为考查指标，设计了L1645正交实验，各因素水平见表1．

表1　正交实验因素水平(L1645)

1.2.3分析方法

苯酚-硫酸法测定发酵液多糖[8]；参照国家安全标准食品中硒的测定方法(荧光法)[8]测定自发酵液中获得的干菌丝体硒含量；菌丝干重的测定：将培养6 d的发酵培养物取出20 mL抽滤得粗菌丝体，用蒸馏水冲洗3次后于60 ℃烘箱中烘干至恒重．

2结果与分析

2.1　硒质量浓度对G6菌株生长的影响

不同质量浓度的亚硒酸钠对G6菌株生长的影响结果见表2．结果显示，添加亚硒酸钠菌株各项指标均优于未施加亚硒酸钠的菌株．当硒质量浓度<50 mg/L时，各菌株菌丝浓密粗壮，长势良好，发菌时间随亚硒酸钠质量浓度的提高而缩短，菌丝体硒含量随亚硒酸钠质量浓度的提高而提高，在50 mg/L时达最高，是无添加硒G6的21倍；硒质量浓度>50 mg/L时，菌丝生长纤弱，发菌时间不再减少，硒含量亦开始降低．结果表明，培养基中添加适量硒可促进菌丝的生长和对硒的富集，过量反而抑制菌丝生长，降低富集硒的能力．

表2　硒质量浓度对G6菌株菌丝生长和硒含量的影响

2.2　G6菌株富硒发酵条件的优化

通过单因素和正交实验对G6菌株液体富硒发酵条件进行优化，分析不同因素对富硒发酵液多糖含量和菌丝体硒含量的影响，以确定最优富硒发酵条件．

2.2.1生长时间对G6富硒发酵液多糖含量和菌丝体硒含量的影响

对G6培养不同时间的发酵液所测得多糖含量和菌丝体硒含量如图1所示．由图1可见，在1~6 d菌丝体硒含量和发酵液多糖含量逐渐升高，6~8 d基本平稳，6 d时发酵液中多糖质量浓度为2.50 g/L，菌丝体硒质量分数为8.51 μg/g，之后略有下降．综合经济节能考虑，选取培养时间为6 d．超过6 d，黑木耳的生长即进入衰退期，致使多糖含量和硒含量开始降低．

2.2.2碳源对G6富硒发酵液多糖含量和菌丝体硒含量的影响

采用4种不同碳源的培养基对富硒黑木耳G6菌株进行液体发酵，测定发酵液多糖含量和菌丝体硒含量，结果见图2．由图2可见，以玉米粉为碳源的培养基的发酵液中多糖质量浓度最高，可达2.91 g/L，菌丝体硒含量以葡萄糖和玉米粉为碳源时最高．表明葡萄糖和玉米粉较其他碳源更适宜黑木耳生长．从成本考虑，确定玉米粉作为富硒黑木耳G6菌株液体发酵培养基的最适碳源．

图1　生长时间对G6富硒发酵液多糖

图2　碳源对G6富硒发酵液多糖

2.2.3氮源对G6富硒发酵液多糖含量和菌丝体硒含量的影响

采用4种不同氮源的培养基对富硒黑木耳G6菌株进行液体发酵，测定发酵液多糖含量和菌丝体硒含量，结果如图3所示．由图3可见，以豆饼粉为氮源的培养基发酵液中多糖质量浓度和菌丝体硒质量分数最高，分别为2.64 g/L和8.60 μg/g．表明豆饼粉为富硒黑木耳G6菌株液体发酵的最优氮源，故选取豆饼粉为培养基的最佳氮源．

2.2.4转速对G6富硒发酵液多糖含量和菌丝体硒含量的影响

4种不同转速条件下培养所得发酵液中的多糖含量和菌丝体硒含量如图4所示．由图4可见，当摇床转速为160 r/min时，发酵液中多糖质量浓度和菌丝体硒质量分数最高，分别为3.64 g/L和8.92 μg/g,所以，确定摇床转速160 r/min为富硒黑木耳G6菌株液体发酵时的最优转速．

图3　氮源对G6富硒发酵液多糖

图4　转速对G6富硒发酵液多糖

2.2.5装液量对G6菌株发酵液菌丝体硒含量和多糖含量的影响

4种不同装液量的三角瓶于摇床发酵后所得发酵液中多糖含量和菌丝体硒含量如图5所示．由图5可见，当装液量为200 mL/500 mL三角瓶时，摇床发酵后所得发酵液中多糖质量浓度和菌丝体硒质量分数最高，分别为3.64 g/L和9.02 μg/g．因此，摇瓶装液量选取200 mL/500 mL三角瓶．装液量的多或少，即耗氧量过高或过低，都会影响菌丝体的正常生长．

图5　装液量对G6富硒发酵液多糖含量和菌丝体硒含量的影响

2.2.6正交实验

以发酵液中菌丝体的硒含量为指标，通过正交实验考察了5个因素对菌丝体硒含量的影响，结果见表3．根据极差分析R值可知，5因素对菌丝体硒含量的影响顺序为A>D>B>C>E，即碳源>生长时间>氮源>转速>装液量，最优组合为A3B4C3D3E3，即优化后的富硒黑木耳G6菌株液体发酵培养条件为硒质量浓度50 mg/L,玉米粉15 mg/L ，豆饼粉20 mg/L，装液量200 mL/500 mL三角瓶，转速160 r/min，25 ℃发酵培养6 d，此时干菌丝体中硒质量分数最高可达8.7 μg/g．

表3　正交实验结果及分析

K.均值；R.极差.

以上述正交实验确定的最优组合在25 ℃发酵培养6 d进行验证实验，验证结果，该组合菌丝体硒质量分数达到9.2μg/g发酵液多糖质量浓度可达3.7g/L．

3讨论

食用菌具有富硒能力，黑木耳也不例外，已被许多研究者的实验所证实[8-10]．高产黑木耳G6菌株也具有富集硒的能力，但亚硒酸钠在培养基中的质量浓度对黑木耳菌丝体的生长及富硒效果会产生很大影响．相比较于不添加亚硒酸钠，适量的亚硒酸钠对黑木耳菌丝体的生长及菌丝体对硒的富集均有促进作用；但过量添加，反而会抑制菌丝体的生长[11]．

培养基可提供微生物生长繁殖和代谢以及合成产物所需要的各种营养物质，其组成和配比对菌体的生长发育、提取工艺及产物成品的产量和质量都有相当程度的影响．在营养成分良好、配比适当的培养基和合适的发酵条件下，菌株能充分发挥其合成产物的能力，可得到良好的生产效果．如果培养基的成分配比或发酵条件不合适，则会影响目的产品的收率和产品的质量．为此，通过单因素和正交实验对富硒黑木耳G6菌株发酵培养条件进行优化，确定了最适富硒发酵条件为硒质量浓度50 mg/L，玉米粉15 mg/L，豆饼粉20 mg/L等，装液量200 mL/500 mL三角瓶，转速160 r/min，25 ℃发酵培养6 d．在此培养条件下，黑木耳富硒G6高产菌株的生长最佳，转化率最高，有机物质积累最多，发酵液中菌丝体硒质量分数达到9.2 μg/g，发酵液多糖质量浓度可达3.7 g/L．

对筛选获得的黑木耳G6菌株富硒摇瓶发酵条件的优化，获得了优质富硒黑木耳菌丝体，为后续放大规模生产菌丝体用于开发富硒黑木耳食药制品的研制提供了实验依据．

参考文献:

[1]CHIHAHA G，MAEDA Y，HAMUO J，et al．Inhibition of mouse Sarcoma 180 by polysaccharides fromLentinusedobes(Berk.) sing[J]． Nature，1969，222(5194)：687-688．

[2]樊一桥，武谦虎，盛健惠．黑木耳多糖抗血栓作用的研究[J]．中国生化药物杂志，2009，30(6)：410-412．

FAN Yiqiao，WU Qianhu，SHENG Jianhui．Study on the antithrombotic effect of polysaccharide ofAuriculariaauriculajudae[J]. Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics，2009，30(6)：410-412．

[3]王献友，陈培云，吴广臣，等．黑木耳多糖提取及其药理活性的研究进展[J]．南方农业学报, 2012, 43(5): 683-687．

WANG Xianyou，CHEN Peiyun，WU Guangchen，et al．Advances on polysaccharide extraction fromAuriculariaauricularand its pharmacological activity[J]．Journal of Southern Agriculture，2012，43(5)：683-687．

[4]FOSTER H D．Selenium and health：insights from the People’s Republic of China [J]．Journal of Orthomolecular Medicine，1989，4(3)：123-135．

[5]RAYMAN M．The importance of selenium to human health [J]．Lancet，2000，356(9225)：233-241．

[6]黄春燕，张柏松，万鲁长，等．食用菌富硒培养研究进展[J]．山东农业科学，2012，44(7)：81-87．

HUANG Chunyan，ZHANG Baisong，WAN Luchang，et al．Research progress of selenium enriched edible fungi cultivation[J]． Shandong Agricultural Sciences，2012，44(7)：81-87．

[7]朱黎霞，周竹音，潘丽媛．黑木耳硒多糖抗肿瘤作用的研究[J]．中国中医药科技，2011，18(5)：454．

ZHU Lixia，ZHOU Zhuyin，PAN Liyuan．Study on antitumor effect of selenium polysaccharide from black fungus[J]．Chinese Journal of Traditional Medical Science and Technology，2011，18(5)：454．

[8]辛树权，王晓光，赵骥民，等．硒元素对黑木耳深层发酵的影响[J]．食品科学，2009，30(7)：202-205．

XIN Shuquan，WANG Xiaoguang，ZHAO Jimin，et al．Effects of selenium on submerged fermentation ofAuriculariaauricular[J]．Food Science，2009，30(7)：202-205．

[9]周丽洁，亢学平，胡志强，等．延特5号黑木耳富硒培养基筛选初报[J]．江苏农业科学，2012，40(11):259-260．

[10]李玲飞，蔡松伟，吴根福．富硒食用菌及其保健功效[J]．食药用菌，2011，19(6)：38-43．

[11]ZHAO Lei，ZHAO Guanghua，ZHAO Zhengdong，et al．Selenium distribution in a Se-enriched mushroom species of the genus Ganoderma[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52(12)：3954-3959．

(责任编辑：赵藏赏)

E-mail：bioinfo5@hbu.edu.cn

E-mail：yajun4502@163.com

Abstract:To obtain Se-enriched Auricularia auricular mycelium, the Se-enriched fermentation conditions of strain G6 of high yield A. auricular was optimized. While the traits and selenium content of mycelium were taken as indicators, the influence of selenium concentration on growing of strain G6 was carried out by adding different concentration of sodium selenite (Na2SeO3) as selenium source in CPDA medium in order to determine the optimum selenium concentration. The Se-enriched liquid fermentation conditions of strain G6 were optimized by single factor and orthogonal test. Experimental results showed that selenium content of mycelium increased with the increase of selenium concentrations when the Na2SeO3concentrations were less than 50 mg/L, and reached the highest value of 8.5 μg/g at 50 mg/L of Na2SeO3concentration, but reduced with the increase of selenium concentration when over 50 mg/L of Na2SeO3concentration. This indicated that the appropriate amount of Na2SeO3helped mycelium absorb selenium, but too much of it would restrain mycelium from growing and was bad for the mycelium to absorbent selenium. Optimized fermentation conditions of strain G6 were the Na2SeO3concentration of 50 mg/L, corn flour 15 mg/L, soybean cake powder 20 mg/L, liquid capacity of 200 mL/500 mL triangle bottle, at the rotate speed of 160 r/min and culture time for 6 d at 25 ℃. Under the fermentation condition, the selenium content of G6 mycelium and the polysaccharide content of fermenting liquid reached to 9.2 μg/g and 3.7 g/L respectively.

Key words:Auricularia auricula; selenium; polysaccharide; fermentation

通信作者：顾雅君(1962-)，女，河北保定人，河北大学副研究员，主要从事真菌及微生物酶学研究．

基金项目：河北省科技支撑计划项目(12227107D-1)

收稿日期：2015-06-25

中图分类号：Q939.96

文献标志码:A

文章编号：1000-1565(2015)06-0616-07

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.06.011