人牙髓干细胞增殖及血管内皮生长因子表达与低氧预处理的关系

田晓蓓　黎　婷　宋文婷　孙晋虎

(徐州医学院口腔医学院,江苏　徐州　221004)



人牙髓干细胞增殖及血管内皮生长因子表达与低氧预处理的关系

田晓蓓黎婷宋文婷孙晋虎

(徐州医学院口腔医学院,江苏徐州221004)

〔摘要〕目的探讨人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达与低氧预处理的关系。方法收集健康完整恒牙，采用组织块酶消化法培养hDPSCs，取3～5代生长良好的hDPSCs分为低氧组(30 ml/O2)和常氧组(210 ml/O2)培养，采用MMT、qRT-PCR和ELISA等技术检测细胞增殖、VEGF表达量。结果低氧组培养第2、3天hDPSCs的增殖活性OD值分别为(0.69±0.13)和(0.90±0.22)，明显高于常氧组(P<0.05)；低氧组和常氧组培养第1、4天hDPSCs增殖活性OD值差异无统计学意义(P>0.05)；hDPSCs分别培养24、48、72 h后，低氧组细胞形态仍呈长梭形，同常氧组的细胞形态相似，两组细胞活性良好，均未发现有细胞坏死的现象发生；低氧组培养24、48和72 h VEGF mRNA相对表达量分别为(2.47±0.08)、(15.07±2.10)和(4.10±0.12)，明显高于常氧组(P<0.05)；低氧组培养24、48和72 h VEGF表达量分别为(598.10±43.18)、(674.84±23.32)和(802.31±23.07)pg/ml，明显高于常氧组(P<0.05)。结论低氧预处理能显著促进hDPSCs增殖及VEGF表达，提示低氧预处理可能对hDPSCs体内移植有利。

〔关键词〕人牙髓干细胞；低氧预处理；血管内皮生长因子；细胞增殖

第一作者：田晓蓓(1979-)，女，硕士，讲师，主要从事牙体牙髓病学研究。

低氧环境普遍参与机体生理病理的发生发展过程，参与胚胎及多种疾病的发生中，相关基础领域研究特别是肿瘤微环境理论认为，间充质干细胞在体内适宜生长环境为轻度缺氧环境，牙髓干细胞作为间充质干细胞，在人体内的生长同样需求低氧环境〔1，2〕。近年来相关牙髓干细胞体外分析研究多数采用常氧环境，而部分学者认为，体外低氧环境下培养牙髓干细胞能显著促进细胞增殖，增加移植成功率，并认为血管内皮生长因子(VEGF)通过自身水平的显著变化，进而促进低氧环境下牙髓干细胞的增殖〔3，4〕。本研究重在探讨人牙髓干细胞(hDPSCs)增殖及VEGF表达与低氧预处理的关系。

1材料与方法

1.1hDPSCs分离培养收集患者因阻生或正畸需要拔除的健康完整恒牙，采用组织块酶消化法培养hDPSCs，当原代细胞长满瓶底超过80%时，行常规传代并扩大培养。

1.2hDPSCs分组培养取3～5代生长良好的hDPSCs接种于60 mm细胞培养皿中，随机分入低氧组(30 ml/O2)和常氧组(210 ml/O2)中培养，其中低氧组氧体积分数从210 ml/O2降至30 ml/O2时间约为2 min，当氧体积分数稳定至30 ml/O2后分别培养24、48、72 h。

1.3MTT法检测hDPSCs增殖取第3～5代牙髓干细胞接种于96孔细胞培养板(3×103)，分为常氧组和低氧组进行培养，每孔设置5个复孔，分为培养1、2、3、4 d，每孔加入20 μl MTT(南京凯基生物科技有限公司，浓度：5 mg/ml)，37℃继续孵育4 h，去除上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min，使用酶标仪(上海华科仪器有限公司 型号：BS-1101)测定波长为490 nm OD值。

1.4细胞活性检测细胞经过相关培养后加入PI/Calcein-AM混合荧光染色液，37℃孵育15～30 min，去除染色液，PBS漂洗一次，显微镜下观察(死细胞染色为红色，活细胞为黄绿色)。

1.5hDPSCs表达VEGF检测VEGF转录水平及蛋白水平的表达差异采用Q-PCR和ELISA检测，所有试剂均购自南京凯基生物科技有限公司，相关检测方法严格按照说明书。

1.6统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1hDPSCs的生长及形态采用组织块酶消化法培养分离得到hDPSCs，约在第6～8天从牙髓组织块边缘游出，倒置显微镜可见细胞呈长梭形、成纤维样细胞形态，胞质丰满，胞核清晰，细胞核椭圆居中，平均3～5 d传代一次，随着生长密度增加，细胞呈放射状或涡旋状排列。见图1。

图1　hDPSCs镜下观察

2.2hDPSCs增殖情况低氧组培养第2、3天hDPSCs增殖活性OD值明显高于常氧组(P<0.05)；低氧组和常氧组培养第1和4天hDPSCs增殖活性无显著差异(P>0.05)，见表1。

2.3细胞活性检测hDPSCs分别培养24、48、72 h后，低氧组细胞形态仍呈长梭形，同常氧组的细胞形态相似，两组细胞活性良好，均未发现有细胞坏死。

2.4hDPSCs VEGF蛋白及mRNA表达情况低氧组培养24 h、48 h和72 h VEGF蛋白和mRNA相对表达量明显高于常氧组(P<0.05)，见表2和3。

表1　两组hDPSCs增殖活性OD值情况

表2　两组VEGF mRNA相对表达量比较

表3　两组VEGF表达比较

3讨论

hDPSCs为存在于人牙髓组织中的间充质干细胞，相关组织微环境理论认为，间充质干细胞具有自我增殖和多向分化潜能，临床上普遍采用从拔出的第三磨牙等牙组织中获取hDPSCs，由于其来源于自身组织，相关移植免疫反应较轻，是较为理想的牙髓再生研究的细胞株〔5〕。目前多数研究仍采用体外常氧环境对于hDPSCs进行培养研究，刘伟等〔4〕发现，常氧培养的间充质干细胞经过移植后，组织缺血缺氧的发生率较高，约65%细胞发生凋亡。而聂姗姗等〔6〕发现，在采用浓度为30 ml/O2的低氧预先处理hDPSCs后，细胞存活率显著增加，同时组织发生缺血坏死的比例呈现降低趋势。文军等〔7〕认为，低氧环境预先处理hDPSCs后，可能通过刺激VEGF生成，进而促进细胞存活，提高移植成功率。低氧是牙髓干细胞较为适宜的生长环境〔8，9〕。Kuo等〔10〕发现，采用浓度为40 ml/O2预先处理牙髓间充质干细胞后发现，细胞增殖活力及活性均较为理想，同时细胞形态较为典型，无明显细胞凋亡及细胞碎片。 Gu等〔11〕通过MTT测定hDPSCs细胞在40 ml/O2低氧环境中增殖效应后发现，在培养中段时间内，OD值所测得的hDPSCs增殖活力较为显著，明显高于常氧环境中的细胞。Kuo等〔10〕通过低氧处理hDPSCs后发现，在低氧处理的3 d内，细胞在450 nm波长处吸光度值明显高于常氧对照组，而 Pisciotta等〔12〕认为，在细胞增殖、再生中具有重要前驱性作用的VEGF可能显著参与低氧促细胞增殖、生长的机制中。Gao等〔13〕发现，低氧处理的hDPSCs其VEGF转录水平表达显著上调，但蛋白水平未予研究。本研究提示VEGF可能显著参与低氧的促增殖效应中。血管再生是牙髓移植的重要组成部分，而VEGF在血管的发生和形成中发挥了中枢性的作用。张男等〔14〕认为，血管再生及血供的及时建立能有效提高细胞移植的成功率，并认为VEGF所介导的内皮细胞增殖、分化和迁移是血管内皮再生的最重要调节因素。史欣〔15〕也认为，VEGF所介导的血管再生作用在低氧促牙髓移植成功的机制中发挥了重要作用。

综上，体外低氧环境可以促进hDPSCs增殖，通过低氧环境预先处理需要移植的细胞能显著增加移植成功率，VEGF基因转录水平及蛋白水平的上调可能显著参与血管再生调节过程中，进而提高移植成功率，但相关具体机制仍需进一步探讨。

4参考文献

1刘庆娜，吴补领，陈婷，等.低氧预处理对人牙髓干细胞增殖和表达血管生成因子的影响〔J〕.牙体牙髓牙周病学杂志，2015;32(2)：68-72.

2冯毅，马静，黄贞.牙髓干细胞促进牙髓血管生成的相关分子机制研究〔J〕.牙体牙髓牙周病学杂志，2013;23(12)：768-72.

3史欣，张鹏飞，袁梦桐，等.骨桥蛋白与矿化液诱导牙髓干细胞向成骨细胞分化的对比研究〔J〕.实用口腔医学杂志，2015;21(1)：11-4.

4刘伟，凌均棨.牙髓干细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究进展〔J〕.国际口腔医学杂志，2014;34(6)：707-11.

5Freund KB，Engelbert M，Fine HF.Individualizing the intravitreal anti-VEGF dosing regimen for long-term management of neovascular AMD〔J〕.Ophthalmic Surg Lasers Imaging Retina，2015;46(5)：508-12.

6聂姗姗，刘佳，张瑞涵，等.牙髓干细胞MHC分子表达与体外混合淋巴细胞的增殖〔J〕.中国组织工程研究，2014;64(50)：8162-7.

7文军，段建民，李洪涛，等.改良富血小板血浆促进乳牙牙髓干细胞成骨分化作用研究〔J〕.实用口腔医学杂志，2014;43(6)：805-8.

8Giurdanella G，Anfuso CD，Olivieri M，etal.Aflibercept，bevacizumab and ranibizumab prevent glucose-induced damage in human retinal pericytes in vitro，through a PLA/COX-2/VEGF-A pathway〔J〕.Biochem Pharmacol，2015;50(4)：19-23.

9Voron T，Tartour E，Taieb J，etal.Impact of VEGF-A in exhaustion of intratumoral T cells〔J〕.Med Sci (Paris)，2015;31(5)：473-5.

10Kuo TF，Lee SY，Wu HD，etal.An in vivo swine study for xeno-grafts of calcium sulfate-based bone grafts with human dental pulp stem cells (hDPSCs)〔J〕.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2015;50(2)：119-23.

11Gu S，Liang J，Wang J，etal.Histone acetylation regulates osteodifferentiation of hDPSCs via DSPP〔J〕.Front Biosci (Landmark Ed)，2013;18(11)：1072-9.

12Pisciotta A，Carnevale G，Meloni S，etal.Human dental pulp stem cells (hDPSCs)：isolation，enrichment and comparative differentiation of two sub-populations〔J〕.BMC Developmental Biol，2015;15(1)：14-5.

13高丽，王玉霞，江文欣，等.转导hTERT基因致人牙髓干细胞永生化的研究〔J〕.上海口腔医学，2015;24(2)：135-40.

14张男，王伟，陈保兴，等.人体牙髓干细胞的分离与鉴定〔J〕.中华细胞与干细胞杂志(电子版)，2014;4(3)：32-5.

15史欣.骨桥蛋白对人牙髓干细胞成骨分化的旁分泌作用的研究〔D〕.哈尔滨：哈尔滨医科大学，2014.

〔2014-09-25修回〕

(编辑苑云杰)

通讯作者：孙晋虎(1969-)，男，博士，教授，主要从事口腔颌面疾病研究。

基金项目：国家自然科学基金项目(No.31060167);徐州市科技项目(No.kc14sh114);江苏青蓝工程学术带头人资助项目(2014)

〔中图分类号〕R31

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6328-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.004