荞麦花叶总黄酮对阿霉素致心力衰竭大鼠心功能及miR133a表达的影响

闫晓红　安可英　毛艳华　宓宝斌　刘　莉

(滨州医学院附属医院老年医学科,山东　滨州　256603)



荞麦花叶总黄酮对阿霉素致心力衰竭大鼠心功能及miR133a表达的影响

闫晓红安可英毛艳华宓宝斌刘莉1

(滨州医学院附属医院老年医学科,山东滨州256603)

〔摘要〕目的探讨荞麦花叶总黄酮(TFBFL)对阿霉素致心力衰竭大鼠模型心功能及miR133a表达的影响。方法选取Wistar大鼠90只，按随机数字表达法随机分为正常对照组、模型组、TFBFL高剂量组(400 mg/kg)，TFBFL低剂量组(100 mg/kg)和卡托普利组(10 mg/kg)，除了正常对照大鼠外，其他四组大鼠予以腹腔注射盐酸阿霉素建立心力衰竭模型，于造模第4周起予以各组大鼠相应的药物进行灌胃治疗，1次/d，连续灌胃3 w。末次灌胃后采用彩色多普勒超声诊断仪测定各组大鼠的心功能指标射血分数(EF)短轴缩短分数(FS)；采用酶联免疫方法检测各组大鼠动脉血清的脑钠肽(BNP)含量；采用荧光定量PCR检测各组大鼠心脏组织miR133a相对表达量。结果①正常对照组大鼠心功能指标EF、FS及miR133a表达水平明显高于模型组(P<0.05)，而动脉血清中BNP含量较模型组明显下降(P<0.01)；②经过卡托普利、TFBFL治疗后三组大鼠EF和FS较模型组明显升高(P<0.01)，而三组动脉血清BNP含量明显低于对照组(P<0.01)，三组间各指标无明显差异(P>0.05)；③经过卡托普利和TFBFL治疗后的三组大鼠心脏组织miR133a mRNA水平明显升高，与正常对照组比较差异显著(均P<0.05)，并以TFBFL低剂量组大鼠升高最为显著；④TFBFL低剂量组大鼠心功能指标及BNP含量改善程度较荞麦花叶总黄酮高剂量组好，但二者无差异(P>0.05)。结论荞麦花叶总黄酮能够明显提高阿霉素导致的心力衰竭模型大鼠的miR133a相对表达量，改善心功能，但心功能改善与荞麦花叶总黄酮剂量未见明显的量效关系。

〔关键词〕荞麦花叶总黄酮；阿霉素；心力衰竭；心功能；miR133a

1海阳市人民医院手术室

第一作者：闫晓红(1979-)，女，主治医师，主要从事临床医学研究。

心力衰竭多发于中老年人群，我国心力衰竭患者的发病率从1990年的0.7%上升至2010年的3.6%，并有逐年上升趋势〔1〕。导致本病原因以原发性心肌损害和心脏负荷过重为主。研究发现〔2〕，从银杏、黄芩等植物中提取的黄酮类化合物具有较好的降脂、扩血管、抗血栓和抗氧化的作用。但国内外从荞麦花叶中提取出来的荞麦花叶总黄酮(TFBFL)对心力衰竭临床疗效的研究报道较少。本文通过观察心功能指标、血清中脑钠肽(BNP)及心脏组织微小RNA(miR133a)表达的水平变化，来探究TFBFL对心力衰竭的影响及作用机制。

1资料与方法

1.1动物6周龄Wistar雄性大鼠90只，平均体重(153±14)g，大鼠购于中国科学院上海动物中心(合格证号：D20021024)。

1.2药品、试剂及仪器TFBFL：将采自于内蒙古库伦旗的荞麦花叶研碎物，水浴加热，收集滤液，3次水浴加热后合并滤液，采用醇提后，干燥滤液，即得TFBFL，经中国药科大学药物研究所鉴定黄酮含量为97.96%；盐酸阿霉素(深圳万乐药业有限公司产，批号0509E1)；卡托普利片(广州白云山制药股份有限公司广州白云山制药总厂，批准文号：国药准字p4021034，2010-07-16)；BNP试剂盒购于赛驰生物公司；Trizol试剂购于美国GIBCO公司；大鼠miR133a核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒、超纯RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒均购于美国Promega公司；Philips-IE33彩色多普勒超声诊断仪，购于美国PHILIPS公司，频率为3～8 mHz小儿心脏探头。

1.3心力衰竭大鼠模型建立及分组将90只Wistar雄性大鼠按随机数字表达法随机分为正常对照组、模型组、卡托普利组(10 mg/kg)、TFBFL高剂量组(400 mg/kg)和TFBFL低剂量组(100 mg/kg)，每组18只。除正常对照组，其他四组大鼠每周一向腹腔注射0.8 mg/L的盐酸阿霉素1次，第1～3周按3 mg/kg剂量注射，第4～6周按2 mg/kg剂量注射，正常对照组每周周一向腹腔注射等剂量的生理盐水1次。腹腔注射盐酸阿霉素第4周同时予以各组大鼠相应的药物灌胃，正常组和模型组予以10 mg/kg生理盐水灌胃；卡托普利组予以10 mg/kg卡托普利灌胃；TFBFL高剂量组给予400 mg/kg TFBFL灌胃；TFBFL低剂量组给予100 mg/kg TFBFL灌胃，各组大鼠灌药治疗3 w，灌药1次/d。采用BL420系统测量左心室功能标志均比正常对照组大鼠低，说明心力衰竭大鼠模型建立成功。

1.4观察指标及检测方法

1.4.1各组大鼠心功能测定五组大鼠治疗3 w后，用10%水合氯醛将大鼠进行麻醉，胸口备皮，采用Philips-IE33彩色多普勒超声诊断仪在超声心动图下观察左室长轴切面、短轴二腔面和四腔面的腔室大小以及室壁的运动情况，采用心功能测定软件包计算和分析射血分数(EF)和短轴缩短分数(FS)，连续测量3个心动周期，取平均值作为EF及FS值。

1.4.2各组大鼠血液中BNP水平测定麻醉理想后，消毒，无菌操作下打开胸腔，剪开心包，暴露心脏及主动脉，抽取主动脉血5 ml，加入含乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝剂的真空管中混匀，采血后，游离心脏，取出心脏浸泡于10%中性甲醛溶液中，固定24 h。动脉血3 000 r/min离心10 min，抽取血清，采用酶联免疫法(ELISA)测定血清中BNP含量。

1.4.3miR133a mRNA水平的检测

1.4.3.1总RNA的提取把取出的心脏组织剪碎、研磨，置于0.2%胶原酶中消化，采用D-Hank液清洗，置于4℃水中冰浴30 min，1 200 r/min离心8 min，制备成单细胞沉淀，向单细胞沉淀中加入1 ml Trizol试剂，采用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA。实验操作按产品说明书进行，用紫外分光光度法测定RNA的A260/A280确定总RNA纯度。

1.4.3.2反转录聚合酶链反应根据逆转录试剂盒要求进行反转录反应操作，按照相关文献资料设计PCR中内参照甘油酯-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和miR133a引物，将RNA模板、引物、5xRT Buffer 和RNase-freeWater溶解并置于冰上备用，将2 μl Primer mix试剂和10 μl消化后RNA分别加入20 μl反应体系的第一部分，混匀。PCR反应体系为：SYBR Premix Ex Taq (2×)10 μl，PCR Forward Primer (10 μmol/L)0.4 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μl，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μl，cDNA模板2 μl，dH2O 6.8 μl，总反应体系为20 μl。经过PCR反应条件的优化,PCR循环条件为94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1 min,共35个循环,最后72℃再延伸5 min。miR133a:引物序列：正义：5′-CACCTATGTAAGATCGCTTC-3′；反义：5′-GCACAATCGCCATAATTATCC-3′，产物大小444 bp；GAPDH正义：5′-TATGACAACTCCCTCAAGAT-3′，反义：5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′，产物大小320 bp。

1.4.3.3结果分析PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,溴化乙啶染色，通过成像分析scion软件计算和比较miR133a产物条带的吸光度值，并与GAPDH条带光密度值比较，计算出miR133a在球囊损伤模型大鼠主动脉组织中mRNA表达含量相对值。

1.5统计学方法采用SPSS17.0统计学分析软件，组间比较进行t检验。

2结果

2.1各组大鼠心功能指标比较正常对照组大鼠心功能指标EF%〔(92.36±3.89)%〕及FS%〔(60.15±7.54)%〕明显高于模型组〔(71.26±4.18)%，(36.48±3.85)%〕(P<0.01)；卡托普利组、TFBFL高、低剂量组大鼠EF%〔(85.32±3.64)%、(80.35±4.84)%、(85.71±4.21)%〕及FS%〔(50.14±6.36)%、(43.36±5.48)%、(49.2±4.59)%〕较模型组升高(P<0.01)，但三组间比较无统计学意义(P>0.05)；TFBFL低剂量组大鼠心功能指标处于一个较高水平，但与TFBFL高剂量组相比无统计学意义(P>0.05)。

2.2五组大鼠心脏组织中miR133a mRNA水平比较正常对照组大鼠心脏组织中miR133a mRNA水平〔(2.85±1.07)%〕明显高于模型组〔(1.21±0.64)%〕(P<0.05)；卡托普利组、TFBFL高、低剂量组治疗后miR133a mRNA水平明显升高分别为(24.87±6.87)%、(4.78±1.49)%、(112.14±4.57)%，与正常对照组相比较差异显著(P<0.05)，并以TFBFL低剂量组大鼠升高最为显著。见图1。

1正常对照组，2模型组，3TFBFL高剂量组，4卡托普利组，5 TFBFL低剂量组图1　五组大鼠心脏组织miR133a 表达水平的变化

2.3五组大鼠主动脉血清BNP水平比较正常对照组大鼠动脉血清中BNP含量〔(15.6±3.67)ng/ml〕明显低于模型〔(45.34±8.74)ng/ml〕(P<0.01)；卡托普利组、TFBFL高、低剂量组〔(18.75±3.48)ng/ml、(29.85±5.64)ng/ml、(27.94±4.67)ng/ml〕与模型组相比明显下降(P<0.01)，但三组间无差异(P>0.05)；TFBFL低剂量组大鼠动脉血清中BNP含量与TFBFL高剂量组相比较低，但无差异(P>0.05)。

3讨论

心力衰竭病情危重、预后差，是心血管疾病的主要死亡原因，严重威胁人类生命健康〔3〕。本病主要因原发性心肌损害及心脏负荷过重为主要基本病因，以呼吸道感染、心律失常为主要诱因〔4〕。阿霉素是临床上常用的广谱抗肿瘤药物，广泛用于对实质性以及血液性恶性肿瘤的治疗，但阿霉素具有严重的心肌毒性，能够引起充血性心力衰竭〔5〕。

miR是一类大小为19～25个碱基内源性非编码RNA，调节细胞的转录，在心血管系统的生理和病理作用有着重要的地位〔6〕，研究表明〔7〕，通过miR133a的表达具有心肌组织特异性，对心力衰竭具有有效的保护作用。正常情况下〔8〕，BNP主要存储于心室肌内，具有扩张血管、增加排钠、对抗肾上腺素、肾素-血管紧张素等引起的水、钠潴留的作用，其分泌量随着心室充盈压高低变化，当心室充盈压升高时，BNP的分泌迅速增加，从而保证心室的搏出量，保证机体的血氧供应量。当心力衰竭时，心室壁张力增加，心室肌应激性增加对BNP分泌，从而导致外周血中BNP含量增加，并且其增高的程度与心衰的严重程度呈正相关，因此血中BNP常常用来评价心衰的进程以及判断预后的指标〔9〕。本研究结果也证实了上述理论观点。

黄酮类化合物是以两个酚羟基的苯环通过中央三碳原子连接而成的一系列化合物，常常连接有酚羟基、甲氧基等功能团。从荞麦花叶中提取出来的总黄酮是一种很强的抗氧化剂，能够有效清除氧自由基，防止细胞退化，能够改善血液循环，降低血胆固醇含量，具有扩张血管、防止血栓形成，有效降低心脏前后负荷，预防和有效治疗心力衰竭〔10〕。卡托普利为血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，是临床中治疗心力衰竭的标准用药〔11〕。本研究结果说明TFBFL能够上调心力衰竭大鼠心脏组织miR133a的表达，对心力衰竭起到保护性作用，改善心肌功能，降低水、钠潴留和心脏负荷，增加EF及FS，这可能与下调心室肌对BNP的分泌有关〔12〕。虽然低剂量的TFBFL能够显著升高心衰大鼠心脏组织miR133a表达，但心功能指标的改善程度与TFBFL的剂量无明显的量效关系。

4参考文献

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〔2015-03-28修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

〔中图分类号〕R54

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6354-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.016