五味子多糖对人结肠癌HT29细胞增殖的抑制作用及其机制

黄晓东　路　倩　范红艳　任　旷

(吉林医药学院药理学教研室，吉林　吉林　132013)



五味子多糖对人结肠癌HT29细胞增殖的抑制作用及其机制

黄晓东路倩范红艳任旷

(吉林医药学院药理学教研室，吉林吉林132013)

〔摘要〕目的探讨五味子多糖含药血清对人结肠癌细胞株HT29体外增殖的影响及作用机制。方法采用人结肠癌细胞株HT29作为研究对象,MTT法检测不同浓度的五味子多糖含药血清对细胞增殖的抑制作用;倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态和细胞核的改变;流式细胞仪分析细胞凋亡的情况。结果五味子多糖含药血清对HT29细胞的增殖有抑制作用而且呈剂量和时间依赖性。五味子多糖含药血清作用72 h后,荧光显微镜可见凋亡细胞及凋亡小体;流式细胞仪检测凋亡。结论五味子多糖含药血清对HT29结肠癌细胞的增殖有抑制作用,其作用机制与诱导细胞凋亡有关。

〔关键词〕结直肠癌；五味子多糖；增殖；细胞凋亡

第一作者：黄晓东(1978-)，男，博士，讲师，主要从事肿瘤药理学研究。

复发和远端转移是结直肠癌患者死亡的最主要原因。有50%以上的结直肠癌患者会在病程中发生肝转移，有30%患者肝部为唯一转移部位〔1〕，伴肝转移患者的死亡率占直肠癌总死亡率的60%以上〔2〕。结直肠癌肝转移患者的术后5年生存率仅为37%～58%〔3〕。可见，有效控制结直肠癌肝转移的发生和发展是治疗结直肠癌的关键。五味子是我国传统中药，味酸、性甘温，具有兴奋呼吸、调节血压、改善智力、保肝、抗肿瘤、抗氧化与抗衰老等作用。五味子多糖(ASPS)是从五味子干燥成熟果实中提取的含有五味子总多糖、十几种氨基酸和十几种微量元素的混合物，具有抗肿瘤、护肝、免疫促进等多种药理活性〔4～6〕。本实验拟观察ASPS对人结肠癌HT-29细胞增殖作用的影响并探讨其作用机制。

1材料和方法

1.1材料人结肠癌细胞株HT-29由吉林大学基础医学院提供；Wistar大鼠，SPF级，40只，雌雄各半，180～200 g，购于吉林大学实验动物中心；ASPS纯度为91.4 %，由吉林大学药学院提供；Hochest染色试剂盒(南京碧波生物科技有限公司)；Annexin V FITC/PI试剂盒、碘化丙啶(PI)(美国Sigma公司)；

1.2方法

1.2.1ASPS含药血清的制备40只Wistar大鼠随机分为生理盐水组(5 ml/kg)、ASPS(400 mg/kg) 组，ASPS(200 mg/kg) 组，ASPS(100 mg/kg) 组。ASPS灌胃给药，2次/d，连续给药7 d。在末次给药后2 h，将大鼠麻醉，腹主动脉采血，4℃ 3 000 r/min离心5 min，分离淡黄色血清。置于56℃水浴，灭活30 min。 0.22 μm微孔滤膜，过滤除菌，-20℃保存。

1.2.2噻唑蓝(MTT)法检测ASPS含药血清对肿瘤细胞HT-29增殖的影响含10%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基加入HT-29 5000个/ml，种于96孔板，200 μl/孔，培养24 h。弃上清，分别加入200 μl含10%的ASPS含药血清，培养72 h。弃去上清，加入200 μl 含0.5 mg/ml MTT的无血清培养基，培养4 h。弃上清，加入200 μl二甲基亚砜(DMSO)，摇床混匀10 min，酶标仪检测570 nm波长处吸光度值，重复3次。

1.2.3ASPS含药血清对HT-29细胞生长的影响取对数生长期HT-29细胞1×105个/ml加入培养瓶中。加入10%的ASPS含药血清，培养48 h，倒置显微镜下观察生长状态。

1.2.4荧光显微镜观察ASPS含药血清对HT-29细胞的影响取对数生长期HT-29细胞1×105个/ml，加入放置有0.9%NaCl溶液处理过的无菌盖玻片的16孔板中，培养24 h。加入10%的ASPS含药血清，培养48 h。吸去培养液，加入1.0 ml 3.7%多聚甲醛，固定10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2遍，吸净液体，加入0.5 ml Hochest33258染色液，染色5 min，封片，荧光显微镜下观察。

1.2.5流式细胞术检测HT-29细胞凋亡取对数生长期HT-29细胞1×105个/ml置于培养瓶中，加入10%的ASPS含药血清，培养24 h。取1 ml细胞悬液，4℃，1 000 r/min离心5 min。PBS洗2次，置于200 μl buffer中，Annexin V FITC/PI避光染色5 min，加入200 μl buffer，样品进入流式细胞仪检测，每组3个复孔，计算平均凋亡率。

2结果

2.1ASPS含药血清对HT-29细胞增殖活性的影响与生理盐水组比较，ASPS 200 mg/kg、400 mg/kg组含药血清对HT-29细胞增殖的抑制明显，OD值分别为0.713±0.060、0.687±0.045(P<0.05，P<0.01)。

2.2ASPS含药血清对HT-29细胞形态的影响倒置显微镜观察，ASPS 400 mg/kg含药血清作用48 h后的HT-29细胞死亡数量明显增多，出现细胞变圆、核皱缩等，总数量比组减少。荧光显微镜可见，生理盐水组表现为活细胞核呈弥散均匀荧光，ASPS 400 mg/kg组，细胞核或细胞质内浓染荧光呈致密的颗粒块状。见图1。

图1　ASPS含药血清对HT-29细胞形态的影响

2.3流式细胞仪检测ASPS含药血清对HT-29细胞凋亡的影响 ASPS含药血清作用24 h后，生理盐水组的HT-29细胞多位于左下象限是正常细胞，凋亡百分率为(4.50±1.18)%，ASPS 200、400 mg/kg组的细胞分布于右上、下限的比例逐渐递增，细胞凋亡百分率为(9.10±1.62)%，(13.90±1.40)%，与生理盐水组比较差异显著(P<0.01，P<0.01)。ASPS 100 mg/kg组细胞凋亡率为(5.22±1.03)%。3讨论

植物多糖因其广谱抗肿瘤能力、低毒且副作用小已经成为理想的免疫调节和抗肿瘤新药。多糖可以调节机体的免疫系统功能，不仅能激活巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、细胞毒T细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)等免疫细胞，还能促进细胞因子生成，调节机体抗体和补体形成，提高机体抗肿瘤免疫力〔7〕。ASPS可提高机体的非特异性免疫功能，升高外周血白细胞数，对环磷酰胺所致的外周白细胞减少有明显的保护作用，具有增强非特异性免疫功能和体液免疫功能的作用，从而促进机体的抗癌功能；还具有抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡的作用〔8〕。细胞凋亡(APO)是指生物体内在有关基因的调控下发生的自主性死亡过程，对肿瘤的发展有重要的意义〔9〕。本文结果表明，ASPS对HT29细胞增殖有抑制作用,其机制与ASPS诱导细胞凋亡有关。

4参考文献

1Ben-David T，Sagi-Assif O，Meshel T，etal.The involvement of the SLEoc select in ligand in the extravasation of human colorectal carcinoma cells〔J〕.Immunol Lett，2008；6(2)：218-24.

2Nawrock B，Polette M，Van Hengel J，etal.Cytoplasmic redistribution of E-cadherin-catenin adhesion complex is associated with down-regulated tyrosine phosphorylation of E-cadherin in human bronchopulmonary carcinomas 〔J〕.Am J Pathol，1998;153(5)：1521-30.

3Scbiesser M,Chen JW,Maddern GJ,etal.Perioperative morbidity affects long-term survival in patients following liver resection for colorectal metastases〔J〕.Gastrointest Surg，2008;12(6)：1054-60.

4颜卉，郗伟斌，兰凤.中草药多糖免疫药理作用的研究进展〔J〕.现代畜牧兽医，2005;5(1):41-2.

5张兰杰，张维华，赵珊红.五味子果实中多糖的提取与纯化研究〔J〕.鞍山师范学院学报，2002;4(1)：58-60.

6黄玲，陈玲，张振林.五味子多糖对荷瘤鼠瘤体抑制作用的病理学观察〔J〕.中药材，2004;24(3)：202-3.

7Hattori TS，Komatsu N，Chichijo S，etal.Protein-bound polysaccharide K induced apoptosis of the human Burlitt lymphoma cell line〔J〕.Namahua Biomed Pharmacother，2004;58(3)：226-30.

8李晓光，高勤，翁文，等.五味子多糖的研究概况〔J〕.时珍国医国药，2006;17(6)：931-2.

9Susin SA，Zamzami N,Castedo M，etal.The central executioner of apoptosis：multiple connections between protease activation and mitochondria in Fas/APO-1/ CD95 and ceramide-induced apoptosis〔J〕.J Exp Med，1997;186(1)：25-37.

〔2014-05-16修回〕

(编辑袁左鸣)

通讯作者：任旷(1963-)，男，教授，主要从事药理学研究。

基金项目：吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(2014547)

〔中图分类号〕R730.52；R735.3

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6337-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.008