浙江省非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测专家共识

浙江省抗癌协会抗癌药物专业委员会专家组

●专家解读

浙江省非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测专家共识

浙江省抗癌协会抗癌药物专业委员会专家组

肺癌是目前我国发病率及死亡率最高的肿瘤，早期诊断、精准治疗、监测复发和转移，对提高肺癌的整体治疗水平和治疗效果尤为重要。非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌的80%～85%，以表皮生长因子受体（EGFR）为靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI）为晚期NSCLC的治疗带来了新的曙光；而EGFR基因突变状态是决定EGFR-TKI疗效最重要的预测因子，检测EGFR基因的突变状态是决定患者是否能够应用EGFR-TKI治疗的先决条件[1]。

肿瘤组织样本（手术、活检、细胞蜡块）是检测晚期NSCLC EGFR突变状态最适合的样本来源。然而并非所有患者都能提供足够的组织样本，可通过经支气管镜、经皮肺穿刺活检或胸腔积液标本来进行突变检测，但仍不能覆盖所有晚期患者[2-3]。在IFUM研究中，仅19%的入组患者能够到检测肿瘤EGFR突变状态，无法检测的原因包括：无法活检，肿瘤组织样本的质量不合格或所含肿瘤细胞数量不够等[4]；组织标本存在空间和时间的异质性也给肿瘤基因的精准检测带来了极大的挑战。而近年来的研究显示存在于外周血中的游离肿瘤DNA（ctDNA）与肿瘤组织基因组DNA具有极为相似的遗传学特性[5-6]，且在肿瘤患者中外周血ctDNA含量显著高于健康人群。数据显示血液EGFR检测水平已经接近组织检测的水平，配对样本检测一致性在60%～95%之间[7]。2014年9月欧洲药品管理局已批准可采用ctDNA标本来评估EGFR突变状态。中国国家食品药品监督管理局（CFDA）在2015年2月也已批准Gefitinib说明书更新，在推荐所有NSCLC患者的肿瘤组织都应进行EGFR突变检测基础上，补充了如果肿瘤标本不可评估，则可使用从血液（血浆）标本中获得的ctDNA。

血液ctDNA EGFR检测具有无创、便捷、实时可获取的特点能在一定程度上帮助解决组织样本量不足、异质性及反复动态活检的问题。但目前血液ctDNA EGFR检测尚存在临床应用范围、适用人群、检测方法等方面标准的不统一，如何有效合理的应用血液EGFR检测已成为临床上亟待解决的问题。2015年5月，浙江省抗癌协会抗癌药物专业委员会在杭州组织我省相关领域专家反复讨论了针对目前血液检测临床应用的几个重点问题，并就浙江省NSCLC血液EGFR基因突变检测的每个问题逐一讨论并形成共识，具体如下：

1 哪一种方法更加适合血液样本的EGFR检测？

目前已有许多血液EGFR基因突变检测方法的报道，如高分辨熔点曲线分析法（HRM）、变性高效液相色谱技术（DHPLC）、突变扩增阻遏系统（ARMS法）、数字PCR方法等[8-10]。不同血浆游离核酸EGFR检测方法各有优势和劣势。

HRM利用不同长度DNA序列具备不同溶解曲线特性，扩增后直接运行高分辨溶解完成对样本的突变分析，操作简单。然而其只能分析纯度单一的小片段DNA，并要求有足够的PCR模板才能得到稳定可靠的结果。DHPLC基于发生错配的杂合与完全匹配的纯合双链DNA解链特征差异分离。但DHPLC不能检测突变类型，结果判读容易出错，并且多个检测步骤增加了工作量[11]。数字PCR在血浆EGFR突变检测上具有较高的灵敏度和特异度[12-13]，但目前报道的该方法检测EGFR突变位点相对有限（19外显子缺失，21号外显子L858R突变以及20号外显子T790M突变），仍处在摸索、累积经验阶段；其对操作人员和环境均有较高的要求，未来应用于临床尚需大规模临床数据验证。以二代测序技术（NGS）为代表的新技术扩展了基因突变检测的深度和广度[14]，但其临床转化应用更需要海量数据积累。

目前成熟且常用检测血液EGFR基因突变的方法是ARMS法，相比于肿瘤组织EGFR检测，该方法检测血浆EGFR敏感型突变的灵敏度在65%～88%，特异度在90%～100%[15-17]。

专家组推荐：检测基因突变常用的方法是ARMS法，欧盟批准用于指导Gefitinib治疗的血液检测方法也是ARMS检测方法[15-17]。检测方法必需都进行严格的验证及质控，检测试剂须使用经国家食品药品监督管理总局（CFDA）批准的检测试剂盒。

2 血液EGFR检测能否替代组织样本，还是作为一个补充方案？

2.1 血液检测与组织检测的一致性 IFUM研究中ctDNA标本检测EGFR突变的高特异度（99.8%）和高灵敏度（65.7%）支持ctDNA可作为NSCLC患者EGFR基因突变检测的样本[16]。因此，欧洲药品管理局2014年9月已批准可采用ctDNA标本评估EGFR突变状态，进而鉴别出最可能从EGFR-TKI治疗中受益的NSCLC患者[18]。Liu等[15]的研究发现，与组织样本相比，血浆EGFR基因突变检测灵敏度为67.5%，特异度为100%；同时，方法学比较显示ARMS方法是检测血浆中EGFR基因突变的最佳方法，该数据与IFUM研究结果一致。因此，中国国家食品药品监督管理局在2015年2月已批准Gefitinib说明书更新。IGNITE研究表明几乎一半的组织阳性患者血浆中可以直接检测到EGFR突变，NSCLC患者血浆中EGFR突变率腺癌为26.3%，非腺癌为6.9%[19]。

2.2 血液EGFR突变状况与临床疗效 IPASS研究中日本亚组人群血清ctDNA EGFR突变状况（ARMS法）与临床疗效的研究数据提示，血清ctDNA EGFR突变阳性的患者接受Gefitinib治疗较标准化疗的无进展生存时间（PFS）显著延长（HR 0.29）[17]。欧洲IFUM研究也提供了在高加索人群基于血浆ctDNA EGFR突变阳性的NSCLC患者（ARMS法）接受Gefitinib治疗的疗效证据，在肿瘤组织阳性，肿瘤组织和血浆标本均阳性及肿瘤组织阳性而血浆标本阴性3组中，其客观缓解率分别为70%、76.9%、59.5%[16]。在FASTACT2研究中，血浆EGFR突变患者接受Erlotinib与化疗联合治疗的客观缓解率（74.6%、19.7%）和PFS（HR 0.21）均优于单纯化疗组[20]。国内一项230例晚期NSCLC患者的临床观察[21]及其他多项临床研究都显示血液标本的EGFR突变对于预测靶向药物治疗的临床获益与组织突变者高度一致。

专家组推荐：虽然血液检测与组织样本检测一致性在60%～95%之间，血液EGFR检测灵敏度尚有提升的空间，组织样本检测仍然是金标准。血液检测用于筛选EGFR-TKI适治患者是重要补充，特别是对于没有合适组织标本供突变检测的患者，可作为组织检测的补充[16]。

3 EGFR血液检测适用于哪些NSCLC患者？

血浆游离DNA在肿瘤患者中的含量高于健康人，这为血液检测奠定了基础，Wang等[22]研究发现NSCLC和健康对照外周血中游离DNA含量分别为5.82ng/μl和4.37ng/μl（P＜0.001）。但并非是所有患者都适用于血液EGFR检测，不同疾病分期患者的血液ctDNA含量是不同的。Bettegowda等[23]比较了不同期别肿瘤中ctDNA的检出率，结果显示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别为47%、55%、69%和82%，相关系数0.337，这说明ctDNA含量与肿瘤分期相关。而EGFR的丰度只有在ctDNA达到一定检出限时才可以被检测到，在Ⅲ期以下的患者检测的灵敏度不高，因此最为适合的是Ⅲ～Ⅳ期患者。

血液检测可动态监测EGFR基因突变的变化，特别是耐药突变的出现；Oxnard等[12]用数字PCR检测NSCLC患者血浆T790M突变，检测灵敏度为0.5%～0.05%，特异度为100%，可在影像学进展前16周检测出血浆T790M突变，并且与19号外显子缺失突变量呈平行的变化关系。今年ASCO上Zheng等[24]报道了EGFR-TKI治疗后耐药的NSCLC患者外周血ctDNA中T790M突变的检出率为47%，血液T790M的发现比临床进展提前了中位时间2.2个月。另外，今年ASCO上一项Rociletinib（Co-1686）治疗血浆T790M阳性患者疗效的研究显示血液T790M检测与组织检测一致性达到81%，具有良好的灵敏度与特异度。血浆T790M阳性和阴性患者的ORR为53%、39%，无论是血浆T790M阳性还是组织阳性ORR均为53%，进一步验证了血液检测的稳定性[25]。

专家组推荐：初治患者方面，一般筛选条件是较晚期的，最好Ⅲ期以上，鉴于组织检测为金标准，考虑无组织标本情况下再选择血液检测。对于经治患者（或复发、PD），由于原先的组织样本或前期的EGFR检测结果对经治后的肿瘤分子病理状态缺少实时参考意义，且很难再取标本，即可选择血液检测，为患者争取机会。早期患者，由于EGFR丰度低以及考虑现有的循证医学证据，不推荐血液EGFR检测。但在早期监测耐药突变等临床研究中，可考虑血液EGFR检测。

4 血液EGFR检测的样本收集和DNA提取

全血中血浆和血清均能分离出ctDNA，但通过和相匹配的血清样本比较，血浆中EGFR有更高的检出率[26]。血浆ctDNA通常片段较短，且在血液中浓度通常非常低[27-28]。抽血后延迟血浆分离会导致血细胞裂解，释放出基因组DNA（gDNA）至血浆中；大量增加的gDNA会稀释肿瘤来源的ctDNA，使得突变难以检出[29]。因此在标本的采集、运输及储存过程中，防止游离DNA的降解是首要考虑的因素；其次，也应防止血液中白细胞的裂解，避免因野生型DNA背景的增加导致ctDNA中的突变DNA无法检测出。

专家组推荐：为了采集到最佳血浆标本用于后续提取游离DNA及EGFR突变检测，建议使用如下两种方法之一采集10ml全血并进一步分离血浆：（1）用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的专用常温采血管采集全血后轻摇混匀，常温（6～30℃）放置不超过5～7d；以足够的离心力将全血充分离心2次，从而分离出不含细胞成分的血浆，放置于-70℃冻存直至DNA抽提，或直接进入DNA抽提步骤。（2）建议用常规EDTA抗凝管（严禁使用肝素抗凝管）采集全血后，2h内以足够的离心力将全血充分低温离心两次[29-30]，分离出不含细胞成分的血浆，放置-70℃冻存直至DNA抽提，或直接进入DNA抽提步骤。为保证ctDNA浓度，建议使用10ml全血分离出的血浆（4～5ml）。ctDNA的提取有很多方法，建议采用国家药监部门批准的、大容量血浆游离DNA分离试剂盒。

5 EGFR突变检测质控及报告

为保证检测结果的可靠性与报告的及时性，专家组推荐：EGFR基因突变的检测须在符合临床核酸扩增实验条件的实验室内开展，进行检测的操作人员必须是接受过培训且技能熟练的工作人员，持PCR培训合格证上岗，同时需要有质量控制和质量保证人员进行质控和监督，以保证检测结果的准确性。为及时满足临床诊治需求，建议各分子检测实验室从接收标本到发出报告周期控制在5个工作日以内。

血液EGFR检测的临床应用将会对NSCLC临床诊疗策略带来影响：（1）很多患者无法检测，初期无法进行靶向治疗。血液检测可以扩大受益人群，给患者一个受益的机会。（2）缩短诊断周期：专业化EGFR分子检测实验室，通过建立高效率的分子检测平台，优化流程，从接收标本到发出报告周期，建议不超过5个工作日，以及时满足临床需求。血液检测由于其便捷性，诊断周期或可缩短，利于临床及时制定治疗方案。（3）NSCLC患者在TKI治疗过程当中会发生耐药，不少文献报道甚至有多次药物敏感、耐药交替出现[31]。检测不同时间的EGFR突变状态，发现各个时期不同的突变状态，进行药物灵敏度的预测，及时使用合适的药物。肿瘤不同时期、治疗的不同阶段，利用便捷的血液检测，动态监测突变状态，调整治疗方案，合适的时间将合适药物用在合适的患者身上，实现精准医疗，意义重大。

6 小结

液体活检入选2015年十大突破技术，肿瘤细胞在凋亡、坏死过程中，会释放肿瘤DNA至血液中，成为血液用于肿瘤个体化诊断的理论基础。血液检测用于筛选EGFR-TKI适治患者是重要补充，特别对于没有合适组织标本供突变检测的患者，可作为组织检测的补充[16]；血液检测可动态监测肿瘤标志物变化，特别是耐药突变的出现[12]；血液检测用于晚期NSCLC有望实现，但对于早期NSCLC有待检测技术不断的发展和进步。

对于ctDNA，基于ARMS平台优化后的方法已有较为成熟的步骤应用于临床服务；而具有高灵敏度的数字PCR方法目前检测EGFR突变位点相对有限（19外显子缺失，21号外显子L858R突变以及20号外显子T790M突变）[12-13]。以二代测序技术（NGS）为代表的新技术扩展了基因突变检测的深度和广度[14]，但其临床转化应用更需要海量数据积累。在未来，期待通过多元化基因检测平台及技术的不断发展与成熟，血液EGFR基因突变检测可实现从定性到定量检测、从静态至动态检测、从单基因到多基因、基因组/外显子组检测，从而推动NSCLC精准靶向治疗的不断进步。

浙江省非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测专家共识，是在浙江省抗癌协会抗癌药物专业委员会的倡导下，从临床检测的角度出发，结合我国肺癌患者（约占全球1/3）众多的现状，综合最新的研究数据和CFDA批准的药物和伴随诊断方法，供临床实践参考。本专家共识将根据实际情况定期更新，期望能为未来进一步优化EGFR阳性肺癌患者的诊断和治疗提供指导。

本版共识专家组成员（按姓氏排序）：陈恩国，浙江大学附属邵逸夫医院呼吸内科；邓清华，杭州市肿瘤医院放疗科；胡炜，台州市中心医院放疗科；江洪，杭州市第一人民医院胸外科；林能明：杭州市第一人民医院药学部；卢丽琴，浙江省人民医院肿瘤内科；马胜林，杭州市第一人民医院肿瘤科；潘月龙，杭州市肿瘤医院肿瘤内科；沈韦羽，宁波医疗中心李惠利医院胸外科；王利民，杭州市第一人民医院呼吸科；王建芳，绍兴市人民医院肿瘤内科；谢聪颖，温州医科大学附属第一医院放化疗科；徐如君，杭州市第一人民医院病理科；许颂霄，浙江大学附属邵逸夫医院病理科；夏冰，杭州市肿瘤医院MDT中心；杨新妹，嘉兴市第一医院肿瘤内科；周建英，浙江大学附属第一医院呼吸内科；张沂平，浙江省肿瘤医院肿瘤内科；赵琼，浙江大学附属第一医院肺移植及胸部肿瘤科；张仕蓉，杭州市第一人民医院杭州市转化医学研究中心

执笔：张仕蓉（E-mail:shirley4444@gmail.com），马胜林（E-mail:mashenglin@medmail.com.cn）

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2015-11-25）

（本文编辑：严玮雯）

马胜林，杭州市第一人民医院，E-mail：mashenglin@ medmail.com.cn