穿心莲内酯对HL－60细胞凋亡、CytC蛋白表达的影响

石静梁勇刚山西医科大学汾阳学院解剖研究室，山西　汾阳　032200

穿心莲内酯对HL－60细胞凋亡、CytC蛋白表达的影响

石静梁勇刚
山西医科大学汾阳学院解剖研究室，山西汾阳032200

【摘要】目的:研究穿心莲内酯诱导人HL－60细胞凋亡及相关机制。方法:以人早幼粒白血病细胞株HL－60为模型，作用于HL －60细胞的穿心莲内酯设3.125、6.25、12.5μg/ml三个受试浓度，实验分为溶媒对照组、穿心莲内酯3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml四个组。采用Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率、流式细胞术结合荧光染色检测穿心莲内酯对细胞色素C(CytC)蛋白表达的影响。结果:穿心莲内酯能促进HL－60细胞凋亡，且呈剂量依赖性。穿心莲内酯作用HL－60细胞24h，CytC蛋白表达增加，12.5μg/ml作用浓度与溶媒对照相比有统计学意义(P＜0.05)。结论:穿心莲内酯能诱导HL－60细胞凋亡，其诱导凋亡机制可能与CytC释放的增加、线粒体通路有关。

【关键词】穿心莲内酯;细胞凋亡; CytC

1　材料和方法

1.1细胞购置及培养人早幼粒白血病HL－60细胞株购于武汉大学细胞保存中心。用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基放置在常规培养箱中传代培养。

1.2样品配置及实验分组根据预实验结果，作用于HL －60细胞的穿心莲内酯(购自天津天士力制药股份有限公司)设3.125、6.25、12.5μg/ml 3个受试浓度。用DMSO溶解穿心莲内酯为50mg/ml贮存液，所需浓度在实验前用RPMI1640培养基稀释生成。实验分为溶媒对照组、穿心莲内酯3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml四个组。

1.3流式细胞仪检测穿心莲内酯作用HL－60细胞24h凋亡率把对数生长期的HL－60细胞浓度调整为1×106 个/ml，以1ml/孔接种于6孔板内，加入不同浓度的穿心莲内酯，作用24h后离心收集细胞，PBS液洗涤细胞两次，按照Annexin V/PI双染法(试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司)步骤操作，1h内上流式细胞仪进行检测，实验结果用WinMDI version2.9软件进行分析。

1.4荧光标记/流式细胞术检测Cytc蛋白的表达细胞的培养、接种、加样品同上。穿心莲内酯作用HL－60 24h后收集细胞，800rpm离心5min后，用250μl PBS液清洗2次后重悬细胞于流式管中，加入20μl荧光标记的Cytc(购自Abzoom公司)，上流式细胞仪进行检测。

2　统计学处理

采用SPSS 11.5统计软件进行数据的统计分析，用x± SD表示所有实验数据，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3　结果

3.1穿心莲内酯作用HL－60细胞24h凋亡定量检测结果显示，和溶媒对照相比，穿心莲内酯各浓度作用于HL－60 24h后，各组细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率均随着穿心莲内酯浓度的升高逐渐升高，量效关系明显;与溶媒对照相比，中、高浓度早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

3.2穿心莲内酯作用HL－60细胞24h CytC蛋白表达变化

结果表明，与溶媒对照相比，不同浓度的穿心莲内酯作用HL－60细胞24h后，CytC蛋白表达逐渐增加，表明穿心莲内酯作用后CytC从线粒体膜间隙释放到胞浆内的量逐渐增加。见表2。

表1　穿心莲内酯作用HL－60细胞24h凋亡定量检测情况表(±sD)

表1　穿心莲内酯作用HL－60细胞24h凋亡定量检测情况表(±sD)

注:与溶媒对照组比较，*P＜0.05。

组别　剂量(μg/ml)早期凋亡率(%)　晚期凋亡率及坏死率(%)溶媒对照/　2.66±1.01　1.85±0.67穿心莲内酯3.125　6.17±0.72　3.68±1.09 6.25　16.28±1.98*　28.43±4.57*12.5　29.16±9.56*　70.27±9.78*

表2　穿心莲内酯作用HL－60细胞24h CytC蛋白表达情况表

4　讨论

恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，可发生在任何年龄段，发病率高，预后不良。不断发掘疗效好、毒副作用低的抗癌中草药是研究的新方向。

笔者在前期研究中发现，穿心莲内酯可以抑制人SKOV3、A431、HL－60细胞增殖，并可诱导SKOV3、A431细胞凋亡，其诱导凋亡可能与线粒体膜电位(MMP)下降有关[1－2]。本研究拟在前期研究的基础上，采用Annexin V/PI双染法流式细胞术检测穿心莲内酯是否能诱导HL－60细胞凋亡、流式细胞术结合荧光染色检测穿心莲内酯对HL－60细胞细胞色素C(CytC)蛋白表达的影响。

Annexin/PI双染法FCM检测结果发现，穿心莲内酯能促进HL－60细胞凋亡，且呈现良好的剂量依赖性; 6.25、12.5μg/ml与溶媒对照组相比，早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率差异有统计学意义(P＜0.05)。

细胞凋亡的信号转导机制十分复杂，其中最常见的就是线粒体通路。由该通路启动的细胞凋亡过程受许多蛋白质的调控，以CytC最常见。

CytC是位于正常细胞的线粒体内、外膜之间。在细胞凋亡信号刺激下，CytC可从细胞的线粒体释放进入细胞的胞浆，这是线粒体凋亡通路的关键步骤。在各种刺激因素作用下，线粒体外膜通透性增加、线粒体通透性转变孔(MPTP)持续性开放、MPP逐渐降低，线粒体通透性转变孔开放后，线粒体基质会肿胀，线粒体外膜更易破裂，释放出细胞色素C等膜间蛋白，最终引起细胞凋亡[3]。实验中我们发现，穿心莲内酯作用HL－60细胞24h后，CytC蛋白表达增加，且高浓度(12.5μg/ml)与溶媒对照组相比有统计学意义(P＜0.05)。这一现象表明:穿心莲内酯作用下，可能使HL－60细胞线粒体膜通透性增高，从而使膜间隙蛋白CytC释放增加[4]。

总之，本研究结果表明，穿心莲内酯能诱导HL－60细胞的凋亡。我们对其机制进行进一步研究中发现，在此过程中CytC蛋白释放增加，进而提示穿心莲内酯可能通过线粒体凋亡途径促进HL－60细胞凋亡。

参考文献

[1]石静，梁勇刚，白慧健，等．穿心莲内酯对SKOV3细胞凋亡及HER2蛋白表达的影响[J]．解剖学杂志，2012，35(1): 20－22．

[2]石静，梁勇刚．穿心莲内酯对人皮肤基底细胞癌A431细胞生长、凋亡及增殖细胞核抗原蛋白表达的影响[J]．解剖学报，2013，44(1): 73 －78．

[3]石静，卿晨．线粒体膜电位改变与细胞凋亡[J]．中国民族民间医药，2011，20(7): 20－21．

[4]蒋时红，吴耀松，刘燕，等．胃康舒宁促胃癌细胞凋亡机制与线粒体凋亡途径[J]．中国实验方剂学杂志，2013，21: 203－206．

收稿日期:( 2014.12.17)

【文章编号】1007－8517(2015)03－0022－02

【文献标志码】A

【中图分类号】R285.5