石菖蒲水提物对PC12细胞增殖及细胞突起的作用

姚　娜，梁　迷，林森相，张　琦，谭　琰，王　旭，王淑艳，华　茜

(1. 天津市血液中心检验科，天津　300110；2. 北京中医药大学基础医学院，北京　100029)



石菖蒲水提物对PC12细胞增殖及细胞突起的作用

姚娜1,2，梁迷2，林森相2，张琦2，谭琰2，王旭2，王淑艳2，华茜2

(1. 天津市血液中心检验科，天津300110；2. 北京中医药大学基础医学院，北京100029)

[摘要]目的研究石菖蒲水提物对PC12细胞增殖及细胞突起的作用，观察药物是否具有神经营养功能或促进细胞分化的功能。方法采用细胞计数试剂盒检测不同浓度的石菖蒲水提物对细胞活力的影响；采用Image J软件统计PC12细胞的梭型细胞率、细胞分化率、细胞突起长度及阳性细胞分化率，以评价石菖蒲水提物对细胞分化的影响。结果石菖蒲水提物在完全培养条件和低血清培养条件下对PC12细胞增殖有显著的促进作用，对细胞突起的长出、分支、延伸有明显的抑制作用。结论石菖蒲水提物具有一定的神经营养功能。

[关键词]PC12；石菖蒲水提物；细胞增殖；细胞突起

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系(pheochromocytoma cells，PC12)在形态和功能上都具有类似神经细胞的特征，被广泛用于研究各种神经系统疾病。神经损伤前期均存在着神经突起萎缩，突触间联系变少、消失，神经细胞丢失等现象。虽然成熟神经细胞不可再生，但一些有限的突起再生、突触重塑的行为还是普遍存在于神经系统中，这给神经系统疾病的治疗带来帮助。因此，改善神经细胞存活环境，促进神经修复已成为研究和治疗的热点。

石菖蒲来源于《神农本草经》，古代文献记载其具有化湿开胃、开窍豁痰、醒神益智的功能，被用来治疗癫痫、痰厥、热病神昏、健忘等疾病。有学者[1]通过统计1980—2011年治疗老年痴呆的临床文献发现，临床上用于改善学习记忆能力的172种中药中石菖蒲使用频率最高，说明其可能具有一定的神经保护作用。现代研究显示，石菖蒲能明显改善模型大鼠的学习记忆能力，缩短通过水迷宫的时间，同时使模型大鼠海马CA区突触后膜致密物质增厚，使神经细胞的细胞器的病理性改变有一定程度的恢复[2]。其不同部位水提物能显著改善β-淀粉样蛋白1-42(amyloid β-protein 1-42，Aβ1-42)致阿尔兹海默病小鼠的学习记忆能力。

本实验采用PC12细胞作为体外模型，研究石菖蒲水提物对细胞增殖和细胞突起的作用，观察其是否具有神经营养功能或者促进神经细胞分化的功能。

1材料

1.1细胞PC12细胞购自中国协和医科大学细胞资源中心。

1.2试验药物石菖蒲水提物由北京中医药大学

神经免疫实验室惠赠，由水提醇沉而得干燥粉末，无菌水配置成100 mg/mL的母液，过滤除菌后于4 ℃长期保存。

1.3主要试剂达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco’s modified eagle medium)：美国Invitrogen；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)：美国Invitrogen；马血清(horse serum，HS)：美国Hyclone；细胞黏附剂：普利莱，北京；细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)：Dojindo，日本；青霉素-链霉素混合液：普利莱，北京。

2方法

2.1CCK法测定细胞活力收取预培养的PC12细胞，经1 000 r/min，离心5 min后用完全培养基(DMEM+10% HS+5% FBS)重悬成单细胞悬液，以每孔1 500的密度接种于96孔板中，待细胞完全贴壁后或次日加入石菖蒲水提物(设置6个浓度组，每组5个复孔)，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养48 h。在检测细胞活力前将培养基替换成无血清DMEM培养基，每孔加入100 μL(含10 μL CCK-8试剂)，继续37 ℃孵育1～4 h，采用多功能酶标仪检测细胞活力，检测波长为450 nm，参考波长为630 nm。在低血清培养环境下检测药物对细胞增殖的作用时，采用低血清培养基(DMEM+1% HS+0.5% FBS)将细胞重悬成单细胞悬液，以每孔2 000的密度接种于96孔板中。

2.2细胞形态学观察为促进细胞分化，降低血清对细胞增殖的促进作用，且同时模拟神经损伤后脑内营养缺乏的环境，在观察细胞形态时采用低血清培养条件进行培养。随着血清浓度的下降，PC12细胞的死亡率将明显升高，贴壁性进一步下降[3]，因此采用细胞黏附剂对培养皿进行提前包被，即用无菌水或者磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)将200倍的细胞黏附剂稀释成1倍的工作液，按照试剂盒说明书将所述剂量加入至培养皿中，随后在37 ℃继续孵育0.5 h，用无菌水或者PBS清洗1～2遍后使用。

选择对数期PC12细胞，经1 000 r/min，离心5 min后用低血清培养基重悬成单细胞悬液，以每孔104的密度接种于预先采用细胞粘附剂包被的24孔板中。次日加入不同浓度的石菖蒲提取物，每组设3个复孔，在37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养48 h。观察细胞形态并在显微镜下随机选择两个视野进行拍照，随后采用Image J软件统计PC12细胞的形态学指标。①梭形细胞率：梭形细胞(包含梭型、多角形及椭圆形细胞)占总细胞的百分比，观察药物对细胞形态的影响。②细胞分化率D1及细胞分化率D2：D1指长出突起的细胞占总细胞数的百分比，D2为长出突起数目>2的细胞占总细胞数的百分比，观察药物对细胞分化并长出突起的作用。③突起长度：每个视野选择具有最长突起的20个细胞，统计其最长突起的平均长度，观察药物对突起延伸的作用。④阳性细胞分化率：突起长度>20 μm为阳性细胞，计算阳性细胞占总细胞数的百分比，观察药物对突起延伸的作用。

3结果

3.1完全培养环境下石菖蒲水提物对细胞增殖的影响在完全培养环境下，浓度<1 000 mg/L的石菖蒲水提物对细胞活力并无抑制效果。与对照组比较，50、200、1 000 mg/L石菖蒲水提物均能明显提高细胞活力(P<0.05)，其中200 mg/L的石菖蒲水提物作用效果最明显(P<0.01)。见图1。

注：含有相同右上标符号的组别相比较，P>0.05；不含相同右上标符号的组别相比较，P<0.05。

3.2 低血清培养环境下石菖蒲水提物对细胞形态的影响加入石菖蒲水提物后细胞形态发生明显变化，突起明显减少甚至消失，细胞变圆，梭型细胞变少，胞体直径相对较小，细胞数量明显增多。见图2。统计学分析结果显示，与对照组比较，50～500 mg/L石菖蒲水提物能够明显抑制细胞形态变为梭型或多角形；10～500 mg/L石菖蒲水提物能够显著降低细胞分化率D1，说明其能抑制细胞长出突起；10 mg/L及50～500 mg/L石菖蒲水提物能够明显降低细胞分化率D2，说明药物能够显著抑制细胞突起长出分支；100～500 mg/L石菖蒲水提物能够显著降低阳性细胞率，50～500 mg/L石菖蒲水提物还能明显减少细胞突起长度，说明药物能够抑制细胞突起延伸。见表1。

图2　低血清培养环境下石菖蒲水提物对细胞形态的影响(10×20倍)

注：同列含有相同右上标符号的组别相比较，P>0.05；同列不含相同右上标符号的组别相比较，P<0.05。3.3低血清培养环境下石菖蒲水提物对细胞增殖的影响低血清培养条件下，加入高浓度的石菖蒲水提物组细胞数量明显增多。与对照组相比，50、100 mg/L石菖蒲水提物能够明显促进细胞活力(P<0.05)。见图3。

注：含有相同右上标符号的组别相比较，P>0.05；不含相同右上标符号的组别相比较，P<0.05。

4讨论

目前认为，石菖蒲的主要成分在于挥发油中，通常采用挥发油或者β-细辛醚作为实验药物，对水提液的研究尤其是在细胞水平上的研究甚少。但多个实验研究都证明，石菖蒲的水提液和挥发油成分均能改善学习记忆能力[4]，说明水提液及挥发油成分中均含有改善学习记忆能力的物质。有文献[5-6]报道，石菖蒲提取物能够抑制缺血再灌注神经细胞的凋亡，具有显著的神经保护作用，其挥发油中的主要成分β-细辛醚作用于PC12细胞后，高浓度组细胞形态发生变化，突起结构消失，细胞变圆，一定浓度的石菖蒲对PC12细胞和皮质神经细胞的增殖有促进作用。从本课题的实验结果来看，石菖蒲水提物具有显著的抑制细胞突起生长，促进细胞增殖的功能，与文献报道有一定的相似性，说明石菖蒲的水提物和挥发油均具有神经营养的功能。石菖蒲的神经保护作用可能与其增强bcl-2基因的表达，防止神经细胞变性有关[7-8]。

本实验中石菖蒲水提物具有显著抑制细胞突起生长、延伸的功能，可能与本实验采用的是石菖蒲的水提液有关。有文献报道，石菖蒲水煎剂可以显著提高小鼠脑内多巴胺和5-羟色胺的含量，说明石菖蒲水煎剂可能是通过降低单胺类神经递质来起到镇静作用[9-10]。石菖蒲去油水煎液具有降低兴奋性氨基酸，拮抗大鼠脑皮质N-甲基-D-天冬氨酸受体与其配体的结合，清除自由基，阻止过氧化物形成的功能[11-13]，提示石菖蒲水提物改善学习记忆能力是从突触功能可塑性及抗氧化应激通路来实现的，可能并不通过改变突触结构可塑性这一通路。

参考文献：

[1]张于．老年痴呆中医研究简史[D]．哈尔滨：黑龙江中医药大学，2012：26-29.

[2]景玉宏，冯慎远，汤晓琴．石菖蒲对学习记忆的影响及突触机制[J]．中国中医基础医学杂志，2002，8(6)：38-39．

[3]潘邓记，张旻，杨明山．血清剥夺致PC12细胞死亡及对细胞周期的影响[J]．华中科技大学学报：医学版，2004，33(5)：566-568．

[4]田素民，马宇昕，孙灵芝，等．石菖蒲不同药效部位改善阿尔茨海默病模型小鼠的认知功能[J]．中国病理生理杂志，2012，28(1)：159-162．

[5]陈奕芝，方永奇，王绮雯，等．β-细辛醚对PC12细胞和乳鼠皮层神经细胞形态学及细胞活力的影响[J]．中药材，2007，30(3)：317-321．

[6]匡忠生，谢宇晖，李翎，等．石菖蒲提取液对脑缺血-再灌注诱导的神经细胞凋亡的保护作用[J]．广东医学，2002，23(5)：459-460．

[7]杨立彬，李树蕾，黄艳智，等．石菖蒲及其有效成分α-细辛醚对癫痫幼鼠脑海马神经元凋亡的影响[J]．中草药，2006，37(8)：1196-1199．

[8]温中京，陈海委．中药石菖蒲提取物对记忆障碍小鼠模型的改善作用研究[J]．中华中医药学刊，2009，27(10)：2203-2205．

[9]张家俊．中药枣酸、龙齿、石曹蒲对小鼠脑内单胺类神经递质及其代谢物的影响[J]．北京中医药大学学报，1995，18(6)：64．

[10]谢婷婷，王虹，刘屏．中药石菖蒲对脑内单胺类神经递质5-羟色胺水平的影响[J]．中国药物应用与监测，2007，4(3)：15-17．

[11]唐洪梅，席萍，吴敏，等．石菖蒲对小鼠脑组织氨基酸类神经递质的影响[J]．中药新药与临床药理，2004，15 (5)：310-311．

[12]唐洪梅，招荣鑑，邓玉群．石菖蒲挥发油和水溶性成分对癫痫小鼠脑组织SOD、LPO、NO的影响[J]．中国药师，2005，8(12)：983．

[13]匡忠生，江湧，李志强，等．石菖蒲提取成分对大鼠脑皮质NMDA、M受体与其配体结合的影响[J]．中药新药与临床药理，2010，21(4)：354-357．

收稿日期：(2014-10-22；编辑：姚实林)

作者简介：姚娜(1987-)，女，硕士，技师

[中图分类号]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.022

基金项目：国家教育部博士点课题博导类项目(20120013110013)