补阳还五汤黄酮类有效成分在Caco-2细胞单层模型的转运特征及对CYP450酶活性的影响

郑　璐，万浩芳，周惠芬，张宇燕，杨洁红，万海同

(1.浙江中医药大学心脑血管病研究所，浙江 杭州　310053；

2.浙江中医药大学药学院，浙江 杭州　310053)



补阳还五汤黄酮类有效成分在Caco-2细胞单层模型的转运特征及对CYP450酶活性的影响

郑璐1，万浩芳2，周惠芬1，张宇燕1，杨洁红1，万海同1

(1.浙江中医药大学心脑血管病研究所，浙江 杭州310053；

2.浙江中医药大学药学院，浙江 杭州310053)

[摘要]目的研究补阳还五汤3个黄酮类有效成分(羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮、芒柄花素)在Caco-2细胞单层模型中的转运特征及其在大鼠肝微粒体中对CYP450酶亚型活性的影响。方法MTT法研究药物在Caco-2细胞单层模型的安全浓度范围，以Caco-2细胞单层模型研究黄酮类有效成分的双向转运机制，以表观渗透系数(Papp)为检测指标，考察时间、浓度以及P-gp抑制剂维拉帕米对转运的影响，利用Cocktail探针法研究药物对CYP450亚型的体外抑制作用。结果从顶侧(apical, AP)到底外侧(basolateral, BL)(AP→BL)，芒柄花素、毛蕊异黄酮的Papp>10-6cm/s，表明其吸收性良好，羟基红花黄色素A的Papp为10-6cm/s，表明其吸收性一般；且三者的转运量随浓度升高和时间延长而显著升高，BL→AP的转运量与AP→BL的转运量的比值小于1.5，其中芒柄花素、毛蕊异黄酮的转运都受到P-gp外排蛋白的外排作用；补阳还五汤黄酮类有效成分明显降低了CYP2E1、CYP1A2酶探针底物的代谢量(P<0.05)。结论3种黄酮类有效成分在Caco-2细胞模型的转运方式均为被动转运，毛蕊异黄酮与芒柄花素明显受到P-gp的外排作用，补阳还五汤黄酮类有效成分可以增加主要通过CYP2E1、CYP1A2酶代谢的药物浓度。

[关键词]补阳还五汤；黄酮类有效成分；药物代谢动力学；Caco-2细胞；CYP450酶

补阳还五汤由黄芪、川芎、当归、赤芍、桃仁、红花和地龙这7味中药组成，具有补气活血通络之效，其中红花中羟基红花黄色素A，黄芪中芒柄花素、毛蕊异黄酮为其中主要的3个黄酮类有效成分。补阳还五汤可舒张血管平滑肌，具有抗凝血酶诱导的血小板聚集活性和激素样作用[1-3]。人结肠腺癌细胞系(the human colon adenocarcinoma cell lines，Caco-2)细胞模型是研究药物吸收的重要手段，可在细胞水平上研究药物分子透过小肠黏膜的吸收、分布、代谢、转运以及毒性的综合信息[4-6]。药物代谢主要场所在肝脏，细胞色素P450酶是其中最重要的酶系。本研究通过吸收和代谢相结合进行补阳还五汤的药物代谢动力学研究，阐明补阳还五汤黄酮类有效成分的吸收代谢机制，为临床用药、方剂学配伍规律研究和中药现代化研究提供参考。

1材料

1.1药品与试剂羟基红花黄色素A标准品：中国药品生物制品检定院，批号 111637-200502，纯度>98%；毛蕊异黄酮标准品：天津马克，批号 201409，纯度>98%；芒柄花素标准品：天津马克，批号 201408，纯度>98%；D-hanks(不含酚红，无Ca2+、Mg2+)：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)：BIOSHARP，Amreso 0793；二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)：美国sigma；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)：杭州四季青；碱性磷酸酶试剂盒：南京建成生物工程研究所；高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)：美国Gibco公司；非必需氨基酸：美国Gibco公司；0.25%胰蛋白酶-0.25%乙二胺四乙酸钠(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)混合消化液：杭州昊天生物；24孔0.4 μm Millicell小室：Millipore corporation；非那西丁(phenacetin，PH)标准品(纯度99.8%)、甲苯磺丁脲(tolbutamide，TOL)标准品(纯度99.6%)、奥美拉唑(omeprazole，OME)标准品(纯度99.8%)、氯唑沙宗(chlorzoxazone，CHL)标准品(纯度99.5%)：美国sigma公司；氯雷他定(loratadine，LOR)标准品(纯度99.8%，批号 100615-201103)：中国食品药品检定研究院；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)四钠盐(纯度>97%，批号 28D10341)：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；水为超纯水；乙腈、甲醇、磷酸为色谱纯，其余均为分析纯。

1.2仪器SHB-ⅢA循环水式真空泵：河南省太康科教器材厂；DZG-6020B恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；Agilent1200高效液相色谱仪：美国Agilent公司；Agilent Extend-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)：美国Agilent公司；AR153CN电子天平：奥豪斯仪器上海有限公司；XS205分析天平：梅特勒-托利多公司；Cascada超纯水仪：美国Pall公司；Millicell-ERS电阻仪：美国Millipore公司；倒置相差荧光显微镜：Nikon；电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；FE20 pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；电热手提压力蒸气消毒器(YXQSG41.280)：上海医用核子仪器厂；6、24、96孔细胞培养板和培养瓶：美国Corning。

1.3细胞Caco-2细胞购于中国科学院上海细胞库，传代数为27~35。

1.4肝微粒大鼠肝微粒体购于美国CHI SCIENTIFIC公司。

2方法

2.1黄酮类有效成分测定

2.1.1色谱条件色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.04%磷酸水，梯度洗脱(0~5 min，10%~15%乙腈；10~15 min，30%~40%乙腈；15~20 min，40%乙腈)；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：240 nm；进样量20 μL。

2.1.2方法学考察

1)标准曲线配制毛蕊异黄酮浓度分别为0.25、0.5、1、2、4、7.5 mol/L，芒柄花素浓度分别为10、20、40、80、150、300 mol/L，羟基红花黄色素A浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3 mol/L的标准溶液(溶于D-Hanks中)，在上述色谱条件下进样分析，分别以羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮、芒柄花素的浓度(x)为横坐标，以峰面积(y)为纵坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归分析，绘制标准曲线，得回归方程分别为y=44.004x+2.081 4，y=8.501 1x+3.201 5，y=5.336 9x+1.846 9；浓度分别在0.2～10、0.5~25、10~500 μmol/L时与峰面积呈良好的线性关系(R2>0.999)。

2)精密度试验分别移取稀释后的标准品储备液适量，根据探针药物的高效液相色谱分析条件进样20 μL，重复进样5次。羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮、芒柄花素峰面积积分值的RSD分别为1.11%、1.86%、0.60%。

3)准确性试验分别移取样品溶液的适量，根据探针药物的高效液相色谱分析条件进样20 μL，重复进样5次。羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮、芒柄花素峰面积积分值RSD分别为0.90%、2.10%、0.73%。

4)稳定性试验取适量羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮、芒柄花素标准品储备液适量，经样品预处理后于0、2、6、10 h，根据探针药物的高效液相色谱分析条件进样20 μL，测得羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮、芒柄花素峰面积积分值的RSD分别为2.28%、1.14%、1.03%。实验结果表明样品在10 h内稳定。

5)加样回收率试验分别取已知含量的3个样品分成3份，分别精密加入高、中、低3个浓度的羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮、芒柄花素储备液适量，根据探针药物的高效液相色谱分析条件测定结果，羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮、芒柄花素的平均加样回收率在95%～105%，且加样回收率的RSD均小于3%，表明该方法准确度良好。

6)专属性实验分别吸取空白液、对照品溶液以及生物样品溶液进行高效液相色谱分析，结果见图1。3个成分的色谱峰分离度大于1.5，理论塔板数不低于3 500，且空白对照在相应位置上未见色谱峰，表明该方法专属性良好。

图1空白液(A)、黄酮类标准品(B)和转运后黄酮类有效成分(C)高效液相色谱图(1. 羟基红花黄色素A；2. 毛蕊异黄酮；3.芒柄花素)

2.2探针药物含量测定

2.2.1液相色谱条件色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱(0~5 min，20%~30%乙腈；5~15 min，30%~50%乙腈)；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：280 nm。

2.2.2方法学考察

1)线性关系考察配制一系列探针药物(PH、TOL、CHL)的标准溶液500 μL，加入2 mL冰冷的乙酸乙酯，漩涡2 min，室温静置10 min，3 000 r/min离心10 min，取1.5 mL有机相，于真空干燥箱干燥后加200 μL乙腈溶解，漩涡2 min，移入Eppendorf管中，16 000 r/min离心4 min，取上层液体，在最佳色谱条件下进样分析。以摩尔浓度(x)为横坐标，以峰面积(y)为纵坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归分析，绘制标准曲线，PH、TOL、CHL的回归方程分别为：y=6.064 2x+0.528 8，y=0.133x+0.644 1，y=5.681 1x+ 0.693 1，浓度分别在0.1～100、0.1~200、1~500 μmol/L时与峰面积呈现良好的线性关系(R2>0.999)。

2)精密度试验分别移取稀释后的PH、TOL、CHL标准品储备液适量，根据探针药物的高效液相色谱分析条件进样20 μL，重复进样5次。PH、TOL、CHL峰面积积分值的RSD分别为0.65%、0.46%、0.57%。

3)准确性试验分别移取样品溶液适量，根据探针药物的高效液相色谱分析条件进样20 μL，重复进样5次。PH、TOL、CHL峰面积积分值的RSD分别为1.39%、0.99%、1.46%。

4)稳定性试验取适量PH、TOL、CHL标准品储备液适量，经样品预处理后于0、2、6、10 h，根据探针药物的高效液相色谱分析条件进样20 μL。测得PH、TOL、CHL峰面积积分值的RSD分别为0.68%、0.76%、0.86%。实验结果表明样品在10 h内稳定。

5)加样回收率试验分别取已知含量的3个样品分成3份，分别精密加入高、中、低3个浓度的PH、TOL、CHL储备液适量，根据探针药物的高效液相色谱分析条件进样20 μL，测得探针药物PH、TOL、CHL的平均加样回收率为95%～105%，且加样回收率的RSD均小于3%，表明该方法准确度良好。

6)专属性实验分别吸取空白液、对照品溶液以及生物样品溶液进行高效液相色谱分析，并进行对比，各色谱峰与相邻色谱峰分离度大于1.5，理论塔板数不低于3 000，且空白对照在相应位置上未见色谱峰(见图2)，表明方法专属性良好。

图2空白液(A)、CYP450探针药物标准品(B)、肝微粒代谢后样品(C)高效液相色谱图(1. PH；2. CHL；3. LOR；4. TOL)

2.3细胞培养将Caco-2 细胞置于含20% FBS、1%非必需氨基酸、青霉素-链霉素双抗液的高糖DMEM中，接种于6孔板上，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱环境下培养，隔日换液。当细胞生长至孔面积的80%左右，用胰酶消化并且传代。

2.4MTT法筛选药物实验浓度将处于对数生长期的Caco-2 细胞以2×104/mL密度接种于96孔板，每孔终容积200 μL，培养24 h。小心吸尽每孔培养液，加入浓度分别为100、200、400、800、1 200 μmol/L的药溶液，空白对照孔仅含培养液，对照组加入细胞和培养液。按照“2.3”项条件培养4 h后，每孔加5 g/L的MTT 20 μL，37 ℃下继续孵育4 h。终止培养后小心吸弃上清液，每孔加DMSO 150 μL，振荡10 min 使结晶物充分溶解，酶标仪检测490 nm 处的吸光度(absorbance, A)值，空白调零，计算细胞存活率(细胞存活率=实验组平均A值/对照组平均A值×100%)。选取细胞存活率≥90%的药物浓度作为非细胞毒浓度，确定为适宜浓度。

2.5Caco-2细胞单层模型制备[7]将对数生长期的细胞以1×105/mL的密度接种于转运孔中，肠腔顶(apical, AP)侧与肠内底外(basolateral, BL)侧分别加0.5、1.5 mL培养基，隔日换液，1周后每天换液，培养至21 d，测定两侧培养液的碱性磷酸酶活性以及各孔采用Millicell-ERS电阻仪测跨膜电阻，当AP侧与BL侧的碱性磷酸酶活性比值接近3∶1以及各孔跨膜电阻大于500 Ω/cm2时，表明Caco-2细胞单层已形成，可以用于转运实验。

2.6转运实验[8]取符合“2.5”项下条件的转运孔，在实验前用预热的D-Hanks液荡洗3次，最后1次在37 ℃培养箱中温孵30 min，吸去废液。用D-Hanks液配制浓度均为150、200、250 μmol/L的3种黄酮类有效成分药液。在AP侧至BL侧的转运实验中，AP侧加药液0.5 mL，BL侧加空白D-Hanks液1.5 mL，设置3个复孔；在BL侧至AP侧的转运中，AP侧加空白D-Hanks液0.5 mL，BL侧加药液1.5 mL，设置3个复孔。

考察P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)抑制剂维拉帕米对黄酮类转运的影响时，先用含维拉帕米(50 μmol/L)的D-Hanks液将细胞孵育30 min，吸去废液，AP侧加黄酮类有效成分药液，BL侧作为接收池，给药后将24孔板置于37 ℃、50 r/min的恒温摇床中，分别于30、60、90、120 min从接收池内取样200 μL，同时用空白D-Hanks液补足，高效液相色谱法检测黄酮类有效成分浓度，计算黄酮类有效成分含量。计算药物的表观渗透系数(Papp)。Papp=(dQ/dt)/(A×c0)，式中dQ/dt为接收池单位时间药物转运量，A为转运膜的面积(0.33 cm2)，c0为药物的初始浓度。

2.7黄酮类有效成分对CYP450亚型的体外抑制作用[9]CYP450底物探针组合为PH(CYP1A2，10 μmol/L)、TOL(CYP2C9，100 μmol/L)、CHL(CYP2E1，20 μmol/L)，最佳孵育时间选定为15 min，0.4 mg/mL为最佳孵育蛋白浓度，通过探针底物的代谢量变化来反映3种黄酮类有效成分对大鼠3种主要CYP450酶亚型活性的影响。

肝微粒体外孵育方法及样品处理：孵育总体积500 μL，包括0.1 mol/L的PBS(pH 7.4)、10 mmol/L MgCl2、0.25 mg/mL肝微粒体蛋白，PH 10 μmol/L、TOL 100 μmol/L、CHL 20 μmol/L的探针药物混合液，以及羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮、芒柄花素各150 μmol/L混合液，羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮、芒柄花素浓度各200 μmol/L的混合液，羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮、芒柄花素浓度各250 μmol/L的混合液。将上述3组药品液分别在37 ℃水浴中孵育5 min，加入1 mmol/L NADPH启动反应。37 ℃水浴中孵育20 min，加入2 mL冰冷的乙酸乙酯终止反应，加入10 μL LOR(1 mmol/L)作为内标，漩涡2 min，室温静置10 min，3 000 r/min离心10 min，取1.5 mL有机相，于真空干燥箱干燥后加200 μL乙腈溶解，漩涡2 min，移入Eppendorf管中，16 000 r/min离心4 min，取上层液体，进行高效液相色谱分析，进样量为20 μL。

3结果

3.1药物浓度筛选通过MTT法检测补阳还五汤中黄酮类有效成分对Caco-2细胞的细胞毒性，计算细胞存活率，结果表明：羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮、芒柄花素在0~0.3 mmol/L为非细胞毒性剂量，即药物与细胞共同培养4 h后，细胞存活率>90%。

3.2黄酮类有效成分转运量与时间和浓度的关系两因素混合设计的方差分析结果显示，被试内因素(时间)和被试间因素(浓度)对3种黄酮类有效成分转运量的主效应均具有统计学意义(P<0.05)，提示浓度越大、时间越长，转运量越大。时间和浓度对3种黄酮类有效成分转运量的交互作用也均具有统计学意义(P<0.05)，从图3中可知，在同一时间点，加药浓度越大，3种黄酮类有效成分的转运量也越大；在相同浓度下，随时间延长，三者从AP→BL转运量呈增长趋势。不同浓度下，羟基红花黄色素A的Papp(AP→BL)为(1.3~1.8)×10-6cm/s，表明羟基红花黄色素A的吸收度不高，芒柄花素与毛蕊异黄酮的Papp(AP→BL)均远大于10-6cm/s，表明芒柄花素与毛蕊异黄酮的吸收良好，提示两者生物利用度良好。见表1。

羟基红花黄色素A的Papp(BL→AP)与Papp(AP→BL)的比值为1.0~1.3；从BL→AP转运量明显大于AP→BL转运量(P<0.05)，初步判定羟基红花黄色素A在AP→BL的转运方式为被动转运。芒柄花素和毛蕊异黄酮的Papp(BL→AP)与Papp(AP→BL)的比值为0.5～1.0。从AP→BL转运量明显大于BL→AP转运量(P<0.05)，初步判定毛蕊异黄酮与芒柄花素在AP→BL的转运方式为被动转运，且可能兼有载体介导的药物外排，见表1。

注：对于同一时间，含有相同右上标字母的浓度组相比较，P>0.05，含有不同右上标字母的浓度组相比较，P<0.05；对于同一浓度，含有相同右上标符号(*△#◇)的时间组相比较，P>0.05，不含有相同右上标符号的时间组相比较，P<0.05。

图3　时间与浓度对羟基红花黄色素A(A)、毛蕊异黄酮(B)、芒柄花素(C)AP→BL转运量的影响(n=3)

注：与Papp(AP→BP)组比较，*P<0.05。

3.3P-gp抑制剂维拉帕米对黄酮类有效成分转运的影响与黄酮类有效成分150 μmol/L给药组相比，加入维拉帕米50 μmol/L可显著提高毛蕊异黄酮与芒柄花素的Papp(AP→BL)(P<0.05)；维拉帕米预处理对羟基红花黄色素A的Papp(AP→BL)无明显影响(P>0.05)。见表2。两因素混合设计的方差分析结果显示，被试内因素(时间)对3种黄酮类有效成分转运量的主效应均具有统计学意义(P<0.05)，被试间因素(组别)对3种黄酮类有效成分转运量的主效应均无统计学意义(P>0.05)。结果提示，随着时间延长，3种黄酮类有效成分的转运量显著增加，维拉帕米对3种黄酮类有效成分转运量无明显影响。见图4。

表2　维拉帕米对3种黄酮类有效成分在Caco-2模型中Papp(AP→BL)的影响s，n=3)

注：与正常加药组比较，*P<0.05。

注：对于同一时间，含有相同右上标字母的浓度组相比较，P>0.05，含有不同右上标字母的浓度组相比较，P<0.05；对于同一浓度，含有相同右上标符号(*△#◇)的时间组相比较，P>0.05，不含有相同右上标符号的时间组相比较，P<0.05。

3.4黄酮类有效成分对CYP450亚型的影响150、200、250 μmol/L黄酮类有效成分混合液对CYP2E1有明显的抑制作用(P<0.05)，250 μmol/L黄酮类有效成分混合液对CYP1A2有明显的抑制作用(P<0.05)，3种浓度黄酮类有效成分混合液对CYP2C9的影响均无统计学意义(P>0.05)。见图5。

注：对同一种CYP450亚型，含有相同右上标字母的浓度组相比较，P>0.05，不含相同右上标字母的浓度组相比较，P<0.05。

4讨论

Caco-2细胞模型与人体吸收机制有良好的相似性，是预测体内吸收，研究药物吸收机制的良好模型[10-14]。采用MTT法测定药物的安全浓度可避免药物浓度过高造成细胞死亡导致的吸收假象。本实验中通过建立合格的Caco-2细胞单层模型作为小肠吸收的体外模型，在补阳还五汤中3种黄酮类有效成分中，芒柄花素、毛蕊异黄酮的Papp(AP→BL)>10-6cm/s，两者随时间延长和浓度升高而显著升高，Papp(BL→AP)与Papp(AP→BL)的比值为0.5～1。初步判定毛蕊异黄酮与芒柄花素在AP→BL的转运方式为被动转运，且可能兼有载体介导的药物外排，同时芒柄花素与毛蕊异黄酮的转运都受到P-gp外排蛋白的外排作用。羟基红花黄色素A生物利用度不高，Papp接近于10-6cm/s；Papp(BL→AP)与Papp(AP→BL)的比值小于1.5，初步判定羟基红花黄色素A在AP→BL的转运方式为被动转运且P-gp抑制剂维拉帕米对羟基红花黄色素A的AP→BL转运无影响。

CYP450为存在于肝脏微粒体混合功能氧化酶系的主要成分，是一组由许多同工酶组成的超基因大家族，其中与药物代谢关系密切的有CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4[15-17]。黄酮类化合物是植物界分布较广的一大类天然化合物，各类中药有效成分中黄酮类化合物对CYP450影响的研究最为广泛，其中羟基红花黄色素A增加CYP2E1的表达量[18]。本实验室参考He F等[19]进行的6种探针的酶动力学研究，对其中3种探针药物进行了单独孵育和混合孵育相同浓度探针的研究，比较两者的代谢速率，最终本实验确定的探针为PH、TOL和CHL，浓度分别为10、100、20 μmol/L。Cocktail探针药物法中孵育时间、蛋白浓度等条件均需进行优化，同时也要考虑到其他情况，例如代谢转化率很低的探针，也要保证其检测灵敏度。本实验室利用大鼠肝微粒体研究补阳还五汤黄酮类有效成分在体外代谢的情况，本实验将孵育时间设定为15 min，0.4 mg/mL作为最终的蛋白浓度。本实验中3种黄酮类有效成分对CYP2E1、CYP1A2均有明显的抑制作用，通过降低CYP450酶亚型的活性，从而导致经此酶代谢的其他药物代谢减慢，血药浓度升高，作用时间延长。提示在临床使用中补阳还五汤黄酮类有效成分可以增加主要通过CYP1A2和CYP2E1代谢的药物浓度，因此在临床用药时应注意合理用药，避免其他药物体内蓄积而产生不良反应。

参考文献：

[1]段晓鹏，贺福元，周晋，等. 补阳还五汤指纹图谱总量统计矩加合性的研究[J]. 中国中药杂志, 2011, 36(23):3247-3252.

[2]李铁军，邱彦，芮耀诚，等.基因芯片分析补阳还五汤对局灶性脑缺血再灌注大鼠的保护作用机制[J]. 中国中药杂志，2004,29(6):559-563.

[3]丁凡，张倩茹，胡元佳，等. 基于网络分析的补阳还五汤防治气虚血瘀型疾病机制研究[J].中国中药杂志, 2014,13(2):574-579.

[4]Silva R, Carmo H, Dinis-Oliveira R.Invitrostudy of P-glycoprotein induction as an antidotal pathway to prevent cytotoxicity in Caco-2 cells [J]. Mol Toxicol, 2011, 85(4): 315-326.

[5]Li Y, Fawcett J P, Zhang H, et al. Transport and metabolism of some cationic ubiquinone antioxidants (MitoQn) in Caco-2 cell monolayers [J]. Eur J Drug Metab Pharmacokinet, 2008, 33(4): 199-204.

[6]杨秀伟, 杨晓达, 王莹, 等.中药化学成分肠吸收研究中Caco-2细胞模型和标准操作规程的建立[J]. 中西医结合学报, 2007, 5(6): 634-641.

[7]毛小琴, 贾雄飞. Caco-2细胞单层模型的建立和评估[J]. 四川医学，2013, 34(1):7-10.

[8]杨秀伟, 郭洁, 徐嵬.芍药苷类化合物在人源肠Caco-2细胞单层模型中的吸收转运研究[J].中草药，2013,44(15):2097-3104.

[9]刘柏东, 吴晓霞, 于友华.黄连解毒汤主要有效成分对人CYP450酶的体外抑制作用研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2014, 20(12):7541-7547.

[10]何丹，颜苗，李焕德，等.甘草提取物及其主要成分对Caco-2细胞膜上P-gp功能和表达的影响[J].中国药学杂志，2010,45(10):751-755.

[11]谭晓婧,陈晓辉,钱忠直,等.肉桂酸在Caco-2细胞模型中的吸收机制研究[J].中国中药杂志,2011,36(8):1091-1093.

[12]Chen Y, Wang Y, Zhou J, et al. Study on the mechanism of intestinal absorption of epimedins A, B and C in the Caco-2 cell model[J]. Molecules, 2014,19(1):686-98.

[13]Teng Z, Yuan C, Zhang F, et al. Intestinal absorption and first-pass metabolism of polyphenol compounds in rat and their transport dynamics in Caco-2 cells[J]. PLoS One, 2012, 7(1):e29647.

[14]Chen Y, Liu X, Pan R, et al. Intestinal transport of 3,6′-disinapoylsucrose, a major active component ofPolygalatenuifolia, using Caco-2 cell monolayer andinsiturat intestinal perfusion models[J]. Planta Med, 2013, 79(15):1434-9.

[15]Paine MF, Hart HL, Ludington SS, et al. The human intestinal cytochrome P450 "Pie" [J]. Drug Metab Dispos, 2006, 34(5): 880-886.

[16]金科涛，王宇光，徐彭，等. HPLC测定大鼠肝微粒体P450活性方法学研究进展[J]. 药物分析杂志，2006，26(3):415-419.

[17]郑蓓蓓．Cocktail法在中药研究中的应用[J]．内蒙古中医药，2014，12(2)：147-182.

[18]孙云帆,王皓晨,范伟强，等.羟基红花黄色素A对四氯化碳急性肝损伤的保护作用[J].山东大学学报：医学版，2009, 47(8) 67-71.

[19]He F, Bi HC, Xie ZY, et al. Rapid determination of six metabolites from multiple cytochrome P450 probe substrates in human liver microsome by liquid chromatography/mass spectrometry: application to high-throughput inhibition screening of terpenoids[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2007, 21(5):635-643.

Transport Characteristics of Flavonoids in Buyang Huanwu Decoction across Caco-2 Cell Monolayer Model and Their Effect on Cytochrome P450 Activity

ZHENGLu1,WANHao-fang2,ZHOUHui-fen1,ZHANGYu-yan1,YANGJie-hong1,WANHai-tong1

(1.InstituteofCardio-CerebrovascularDisease,ZhejiangUniversityofChineseMedicine,ZhejiangHangzhou310053,China; 2.CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhejiangUniversityofChineseMedicine,ZhejiangHangzhou310053,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the transport characteristics of flavonoids (hydroxysafflor yellow A, formononetin, and calycosin) in Buyang Huanwu Decoction (BYHWD) across Caco-2 cell monolayer model and their effect on cytochrome P450 (CYP450) activity in rat liver microsomes. MethodsThe safe concentration range of flavonoids in Caco-2 cell monolayer model was determined by MTT assay. The mechanism of bidirectional transport of flavonoids was investigated using the Caco-2 cell monolayer model. The influence of time, concentration, and P-gp inhibitor verapamil on the transport of flavonoids was studied using apparent permeability coefficient (Papp) as the index. The in vitro inhibitory effect of flavonoids on CYP450 activity was studied by the Cocktail method. ResultsThe Pappof formononetin and calycosin in the transport from apical (AP) side to basolateral (BL) side were more than 10-6cm/s, which showed a good absorption, but the Pappof hydroxysafflor yellow A was 10-6cm/s, which showed an ordinary absorption. In the Caco-2 cell monolayer model, the transport of the three compounds was positively correlated with time and concentration, and the ratio of the transport from BL side to AP side to that from AP side to BL side was lower than 1.5. The transport of formononetin and calycosin was rejected by P-gp, and the flavonoids in BYHWD significantly reduced the metabolism of CYP1A2 and CYP2E1 probe substrates (P<0.05).ConclusionThe transport of the three flavonoids across Caco-2 cell monolayer model is passive, and formononetin and calycosin are rejected by P-gp. The three flavonoids in BYHWD can increase the concentration of the drug metabolized through CYP1A2 and CYP2E1.

[Key words]Buyang Huanwu Decoction; flavonoids; pharmacokinetics; Caco-2 cell; cytochrome P450

收稿日期：(2015-01-22；编辑：姚实林)

通信作者：万海同，whtong@126.com

作者简介：郑璐(1986-)，女，硕士研究生

[中图分类号]R969[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.021

基金项目：国家自然科学基金项目(81274176，81202636)；浙江省自然科学基金项目(LR12H27001)；浙江省教育厅科研资助项目(Y201329166)