消肿方对骨关节炎兔软骨下骨成骨细胞OPG及RANKL mRNA表达的影响

李　亮，刘安平，周正新，周章武，徐盛文，李文华

(安徽中医药大学第一附属医院骨伤科，安徽 合肥　230031)



消肿方对骨关节炎兔软骨下骨成骨细胞OPG及RANKL mRNA表达的影响

李亮，刘安平，周正新，周章武，徐盛文，李文华

(安徽中医药大学第一附属医院骨伤科，安徽 合肥230031)

[摘要]目的观察消肿方对骨关节炎兔软骨下骨成骨细胞骨保护素(osteoprotegerin，OPG)及核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)mRNA表达的影响。方法将30只新西兰大耳白兔随机分为空白对照组，模型组，消肿方低、中、高剂量组，每组6只。采用改良Hulth法复制膝关节骨关节炎模型，消肿方低、中、高剂量组分别给予40、80、160 g/kg消肿方煎剂灌胃，空白对照组和模型组分别以等容积生理盐水灌胃，共28 d。光镜下观察兔膝关节关节软骨下骨成骨细胞形态，采用RT-PCR法检测OPG、RANKL mRNA的表达。结果空白对照组与模型组OPG mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P<0.05)；消肿方高、中、低剂量组OPG mRNA表达水平均较模型组显著升高(P<0.05)，具有明显的剂量依赖性。模型组RANKL mRNA表达水平低于空白对照组，消肿方低、中、高剂量组RANKL mRNA表达水平较模型组逐渐降低，但差异均无统计学意义(P>0.05)；消肿方高剂量组RANKL mRNA表达水平显著低于低剂量组(P<0.05)。结论消肿方可上调骨关节炎动物模型软骨下骨成骨细胞OPG mRNA表达，下调RANKL mRNA表达。

[关键词]消肿方；骨关节炎；补肾活血利水法；成骨细胞；骨保护素；RANKL

消肿方是安徽中医药大学第一附属医院骨伤科国家级名老中医丁锷教授的经验方，以补肾活血利水为主，对骨关节炎具有较好的疗效[1]。前期研究显示，补肾活血利水法可促进软骨细胞增殖，抑制骨细胞凋亡，调控滑膜组织基因表达谱，其作用机制与多种细胞信号通路有关[2]。其中骨保护素/核因子-κB受体活化因子配体(osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor-kappa-B ligand，OPG/RANKL)通路对骨关节炎软骨下骨重建的调控作用已成为研究热点之一[3]。本研究通过复制兔骨关节炎动物模型，观察不同浓度消肿方对骨关节炎动物的软骨下骨成骨细胞OPG及RANKL mRNA表达的影响，以探究消肿方治疗骨关节炎的机制。

1材料

1.1实验动物7月龄新西兰大耳白兔30只，体质量2.6～3.2 kg，雌雄各半，购自安徽中医药大学动物实验中心，普通级。

1.2实验药物与试剂OPG、RANKL多克隆抗体：武汉博士德试剂公司；实时定量PCR扩增仪：美国Roche公司；TRIzol试剂：美国Life Technologies公司；逆转录试剂盒：美国Qiagen公司；DNA marker：北京天为时代公司；引物：上海沪晶生物芯片公司。

消肿方(茯苓皮20 g，怀牛膝、黄芪各15 g，当归、萆薢各10 g，莪术8 g，等)生药饮片由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供，制备成不同浓度的水煎剂。

1.3仪器石蜡切片机：Leica2135；BM-Ⅱ型病理组织包埋机：安徽省电子科学研究所；ZT-RP生物组织脱水机、QP切片漂烘温控仪：湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司；Nikon80荧光显微镜：新飞达光学仪器公司。

2方法

2.1动物模型复制及分组将30只新西兰大耳白兔随机分为5组：空白对照组，模型组，消肿方低剂量(40 g/kg，相当于临床剂量3倍)、中剂量(80 g/kg)、高剂量(160 g/kg)组，每组6只。除空白对照组外，其余各组动物采用改良Hulth法[4]复制膝骨关节炎模型。3%戊巴比妥钠按30 mg/kg静脉注射麻醉，麻醉生效后，常规无菌操作、铺巾，取兔膝关节前内侧髌旁入路，切开皮肤及皮下组织、内侧支持带及关节囊后，将髌骨向外侧脱位，显露膝关节腔，显露内侧半月板及前交叉韧带，依次切除内侧半月板，切断内侧副韧带，切断前交叉韧带，再逐层关闭关节囊、皮下组织、皮肤，敷料包扎切口，不予外固定，复制模型后连续4 d用青霉素3万U肌肉注射，10 d后开始每天强迫兔活动40 min，连续6周。对消肿方低、中、高剂量组兔分别灌胃给予40、80、160 g/kg消肿方煎剂，对空白对照组和模型组兔灌胃给予生理盐水，连续28 d。

2.2膝关节软骨细胞形态学观察在相对无菌条件下于膝关节负重区用骨刀垂直于股骨髁关节面切取骨软骨组织块，并去除关节软骨周围的软组织及骨组织，磷酸盐缓冲液漂洗，用无水乙醇固定，脱钙处理，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色，光镜下观察关节软骨细胞。

2.3软骨下骨成骨细胞总RNA提取及测定采用TRIzol一步法，按产品操作说明提取软骨下骨成骨细胞总RNA。采用紫外分光光度计测定总RNA的光密度(optical density，OD)，计算OD260/OD280比值，测定其浓度和纯度。RNA完整性的检测采用普通琼脂糖凝胶电泳法，提取的总RNA于-70 ℃保存。

2.4兔软骨下骨成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达采用RT-PCR法，以β-actin基因为内参。OPG反应条件[5]：95 ℃高温变性1 min，54 ℃降温退火40 s，71 ℃升温延伸1 min，共30个循环，最后71 ℃升温延伸7 min。RANKL反应条件：95 ℃高温变性1 min，54 ℃降温退火40 s，71 ℃升温延伸1 min，共30个循环，最后71 ℃升温延伸7 min。引物序列：OPG上游引物：5′-TGTGGCCATGCGTTCTAGTCACCT-3′，下游引物：5′-TAGGGACCCAAGCCTTGCATCGGA-3′，扩增长度为478 bp；RANKL上游引物：5′-TTCCTCGAACTCAGTGCGAGAG-3′，下游引物：5′-CCGACCTGAGGTAATTCGCGTC-3′，扩增长度为449 bp；β-actin上游引物：5′-GAAGGCAGACGTTCAACACGGC-3′，下游引物：5′-GTGGCCATCTCACTTGCTGCAACAG-3′，扩增长度为310 bp。以15 g/L琼脂糖凝胶进行电泳并拍照，对条带的OD值进行检测，计算条带OD值与β-actin OD值的比值。

3结果

3.1兔膝关节软骨细胞形态学变化空白对照组兔关节软骨厚度正常，关节软骨细胞形态正常，排列均匀(见图1A)；模型组兔关节软骨厚度变薄，关节软骨细胞形态不规则，排列较散乱(见图1B)；各治疗组可见关节软骨厚度明显改善，关节软骨细胞形态不规则，排列散乱，随治疗药物剂量增加，软骨细胞数量增加(见图1C—1E)。

图1各组兔膝关节软骨细胞形态(HE染色，10×40倍)

3.2兔软骨下骨成骨细胞总RNA质量鉴定提取软骨下骨成骨细胞的总RNA，经分光光度计分别在260 nm和280 nm波长测定OD值，计算OD260/OD280比值，所有样品总RNA的OD260/OD280比值均在1.80～2.10之间。经普通琼脂糖凝胶电泳分析，结果提示RNA未被降解。

3.3各组兔软骨下骨成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达比较空白对照组与模型组OPG、RANKL mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；消肿方高、中、低剂量组OPG mRNA表达水平均较模型组显著升高(P<0.05)，RANKL mRNA表达水平均较空白对照组显著降低(P<0.05)；随着消肿方剂量升高，OPG mRNA表达水平显著升高(P<0.05)，RANKL mRNA表达水平逐渐降低，其中消肿方高剂量组RANKL mRNA表达水平显著低于低剂量组(P<0.05)。见图2、表1。

注：1. Marker；2. 空白对照组；3. 模型组；4. 消肿方低剂量组；5. 消肿方中剂量组；6. 消肿方高剂量组。

表1　各组兔软骨下骨成骨细胞OPG、RANKL mRNA相对表达水平比较

注：同列含有相同右上标符号的组别相比较，P>0.05；同列不含相同右上标符号的组别相比较，P<0.05。

4讨论

有研究[6]表明，OPG/RANKL系统是破骨细胞与成骨细胞之间发生互相作用的信号通道，OPG最初于1997年被两个独立的实验室同时发现。RANKL分子由317个氨基酸组成，有一个细胞外结构域(其中包含一个配基结合位点)、一个跨膜结构域和一个N端胞浆结构域组成，可由T、B淋巴细胞、骨髓干细胞、成骨细胞前体细胞以及成熟的成骨细胞等分泌。

最近研究[7]发现，成骨细胞能产生巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)和RANKL，能够与位于破骨细胞前体上的受体相结合，从而能刺激破骨细胞的增殖和分化，并能增加破骨细胞活力；而成骨细胞则能产生一种名为OPG的蛋白，与RANKL相结合，从而阻止RANKL与破骨细胞的相互作用。RANKL和OPG的平衡对于骨破坏速度起着关键性的作用。在雌激素缺乏的人群中，其体内RANKL水平增加[8]，当RANKL水平过高或者OPG水平不足，将会引起骨丢失，但血液中RANKL和OPG的含量测量结果却不支持该理论。在骨折及低骨量患者中，OPG水平升高，RANKL水平降低[9-10]。有关大鼠骨关节炎动物实验表明，关节软骨退变程度增加时，RANKL及runt相关转录因子(runt-related transcripttion factor，RUNX)、MCSF、血管内皮生长因子等多种物质显著增加，而OPG的表达却降低[11]。

骨关节炎相当于中医学“痹证”，其为本虚标实之病。肾主骨、主水，肾虚则骨关节失养、水无所主，可致局部肿胀；外伤或劳损可致局部气血运行不畅，形成瘀血，则出现疼痛。故本病以肝肾亏虚为本，气滞血瘀、筋脉痹阻为标，通过中药内服外用以补肝肾、强筋骨、疏经络，达到标本兼治的目的[12]。消肿方重用牛膝以补肝肾、强筋骨、利水祛湿、活血化瘀、引血下行，用于痹痛日久、腰膝酸痛等症，为君药；茯苓健脾利水、渗湿消肿，黄芪健脾补中益气，为治疗气虚水肿之要药，两者合为臣药；莪术行气破血、消积止痛，偏于行气通络止痛，用于痰湿阻滞所致的肢体关节疼痛；萆薢利水渗湿、祛风除痹、通络止痛，善治腰膝痹痛、筋脉屈伸不利，两药同为佐使药。全方配伍，共奏补肾利水、活血化瘀之功，对痰、瘀、水互阻所致的骨关节炎能起较好的治疗作用。本研究结果表明，消肿方中药煎剂可显著提高骨关节炎兔软骨下骨成骨细胞OPG mRNA的表达水平，同时可降低成骨细胞RANKL mRNA的表达水平。由此可见，消肿方可能通过上调OPG mRNA的表达和下调RANKL mRNA的表达，抑制破骨细胞的活化，从而抑制破骨细胞的骨吸收功能。

参考文献：

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[2]李亮，刘安平，周正新，等.补肾活血法治疗膝关节骨关节炎的作用机制研究[J].河南中医，2014，34(3)：50-52.

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Effects of Detumescence Prescription on mRNA Expression of Osteoprotegerin and Receptor Activator of Nuclear Factor-Kappa B Ligand in Subchondral Bone Osteoblasts in Rabbits with Osteoarthritis

LILiang,LIUAn-ping,ZHOUZheng-xin,ZHOUZhang-wu,XUSheng-wen,LIWen-hua

(DepartmentofOrthopaedics,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of detumescence prescription on the mRNA expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) in subchondral bone osteoblasts in the rabbit model of osteoarthritis. MethodsThirty New Zealand big-eared white rabbits were randomly and equally divided into blank control group, model group, and low-, middle-, and high-dose detumescence prescription groups. A model of knee osteoarthritis was established with the modified Hulth method. The low-, middle, and high-dose detumescence prescription groups received decoction of detumescence prescription (40, 80, and 160 g/kg, respectively) by gavage, while the blank control group and model group received an equal volume of normal saline by gavage. The course of treatment was 28 d for each group. The morphology of subchondral bone osteoblasts of the knee joint was observed under a light microscope. The mRNA expression of OPG and RANKL was measured by RT-PCR.ResultsThere was no significant difference in OPG mRNA expression between the blank control group and the model group (P>0.05); the high-, middle-, and low-dose detumescence prescription groups had significantly increased OPG mRNA expression compared with the model group (P<0.05), showing a significant dose dependence. The model group had lower RANKL mRNA expression than the blank control group, and the low-, middle-, and high-dose detumescence prescription groups had gradually reduced RANKL mRNA expression compared with the model group (P>0.05); the RANKL mRNA expression was significantly lower in the high-dose detumescence prescription group than in the low-dose detumescence prescription group (P<0.05). ConclusionDetumescence prescription can up-regulate the OPG mRNA expression and down-regulate the RANKL mRNA expression in subchondral bone osteoblasts in the rabbit model of osteoarthritis.

[Key words]detumescence prescription; osteoarthritis; kidney-tonifying, blood-activating, and diuresis-promoting therapy; osteoblast; osteoprotegerin; receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand

收稿日期：(2014-09-24；编辑：曹健)

[中图分类号]R684.3[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.019

作者简介：李亮(1979-)，男，硕士，主治医师