超滤离心法测定银杏内酯B纳米结构脂质载体包封率

周　恺，姚　亮，戴浩志，林彤远，朱婷婷，邢　蓉，陈卫东

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥　230012；2.蚌埠医学院第一附属医院，安徽 蚌埠　233000)



超滤离心法测定银杏内酯B纳米结构脂质载体包封率

周恺1，姚亮1，戴浩志1，林彤远1，朱婷婷1，邢蓉2，陈卫东1

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012；2.蚌埠医学院第一附属医院，安徽 蚌埠233000)

[摘要]目的建立超滤离心法测定银杏内酯B(ginkgolide B，GB)纳米结构脂质载体(nanostructured lipid carrier，NLC)包封率的方法，以便对GB-NLC处方进行优化。方法利用乳化蒸发-低温固化法制备GB-NLC，在电镜下观察其微观形态，用纳米激光粒度仪测定其粒径和Zeta电位。建立超滤离心测定包封率方法，分离载药NLC与游离GB，采用LC-MS/MS测定包载GB或游离GB含量，并计算包封率。结果制得GB-NLC外观圆整，平均粒径和电位分别为(173.10±5.84)nm和(-27.47±0.40)mV；超滤离心法测得包封率为(61.97±1.03)%。结论超滤离心法准确、快捷，适合作为GB-NLC包封率的测定方法。

[关键词]银杏内酯B；纳米结构脂质载体；包封率；超滤离心法

银杏内酯B(ginkgolide B，GB)是从银杏叶中提取的三萜内酯类化合物，对心脑血管疾病具有显著的药理活性[1-2]，是极具应用前景的天然血小板活化因子受体拮抗剂[3]。然而GB在水中溶解度低、半衰期短等缺点限制了其临床应用[4]。纳米结构脂质载体(nanostructured lipid carriers，NLC)是第二代脂质纳米粒，特点为采用液体脂质以及固体脂质作为混合脂质核心包载药物，可实现缓释效果，延长药物半衰期[5-7]。

评价NLC质量的重要指标之一就是包封率。

[Abstract]ObjectiveTo study the effects of aqueous extract of Acorus tatarinowii on PC12 cell proliferation and processes and to evaluate whether the drug has a neurotrophic function or promotes cell differentiation. MethodsCell Counting Kit-8 was used to determine the effect of different concentrations of aqueous extract of Acorus tatarinowii on the viability of PC12 cells. The spindle cell rate, cell differentiation rate, length of cell processes, and the differentiation rate of positive cells were statistically analyzed using Image J software to evaluate the effect of aqueous extract of Acorus tatarinowii on PC12 cell proliferation. ResultsThe aqueous extract of Acorus tatarinowii significantly promoted PC12 cell proliferation in both complete culture environment and low-serum culture environment and significantly inhibited the growth, branching, and extension of cell processes. ConclusionThe aqueous extract of Acorus tatarinowii has a certain neurotropic function. Objective To develop a method for determination of the entrapment efficiency of ginkgolide B (GB)-loaded nanostructured lipid carriers (NLC) and to optimize GB-NLC-based prescriptions.MethodsGB-NLC was prepared by emulsion evaporation and low-temperature solidification. The micromorphology of GB-NLC was observed under a scanning electron microscope. Particle size and Zeta potential were also determined using a laser particle size analyzer. A centrifugal ultrafiltration technique was developed to isolate free GB from GB-NLC solution. The concentrations of free GB and entrapped GB were measured with liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and the entrapment efficiency was calculated. ResultsThe GB-NLC appeared spherical with a smooth surface. The average particle size and Zeta potential were (173.10±5.84)nm and (-27.47±0.40)mV, respectively. The mean entrapment efficiency determined by the centrifugal ultrafiltration technique was (61.97±1.03)%. ConclusionThe centrifugal ultrafiltration technique offers an accurate and fast method for determining the entrapment efficiency of GB-NLC.

[Key words]PC12; aqueous extract of Acorus tatarinowii; cell proliferation; cell processes常见的包封率测定方法包括超速离心法[8]、透析法[9]、微柱离心法[10]及超滤离心法[11]等。其中透析法耗时长，且需要大量透析介质；超速离心法则对仪器有较高要求，高转速下可能导致纳米粒破裂；微柱离心法需要人工装填凝胶填料，重现性较差，且受人为影响较大。因此，笔者建立了超滤离心法测定GB-NLC包封率的方法。 ginkgolide B; nanostructured lipid carrier; entrapment efficiency; centrifugal ultrafiltration

1仪器和试药

1.1仪器Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；AB SCIEX 4500三重四级杆质谱：上海爱博才思仪器贸易有限公司；SU8020扫描电镜：日本日丽公司；3000HS型Zetasizer纳米激光粒度仪：美国Malvern公司；AB-135型分析天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Milli-Q Reference超纯水系统：密理博(上海)贸易有限公司；LC-4016低速离心机：中科中佳科学仪器有限公司；XW-80A涡旋混合仪：上海沪西仪器有限公司；DF-101S集热式加热搅拌器：江苏省常州普天仪器制造有限公司；Amicon Ultra-4超滤离心管：密理博(上海)贸易有限公司。

1.2试剂GB标准品(批号 110863-200806)：中国药品生物制品检定院；银杏内酯B原料药：中国人民解放军总医院；格列苯脲(glibenclamide，GLY)标准品(批号 100135-200404)：中国药品生物制品检定院；单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、中链甘油三酯、卵磷脂、吐温80：国药集团化学试剂有限公司；色谱甲醇：德国默克公司；超纯水：实验室自制；其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1GB-NLC制备采用乳化蒸发-低温固化法制备GB-NLC。具体步骤如下：称取处方量单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、中链甘油三酯、卵磷脂和GB原料药，加乙醇和丙酮混合溶液溶解，作为有机相。称取处方量吐温80，加入到纯水中，作为水相。待水相加热至恒定温度后，将有机相缓慢加入到水相中，并保持恒定速率搅拌，得初乳。再将初乳迅速倒入冰水中持续搅拌一段时间，得GB-NLC溶液。移除GB原料药，按上述方法制备可得空白NLC溶液。

2.2微观形态观察取适量GB-NLC溶液，滴加数滴于干净的铜片之上，自然挥干之后，在铜片上进行镀金以增加导电性，置于扫描电镜下观察微观形态并拍照，结果见图1。

2.3粒径及Zeta电位测定取适量GB-NLC溶液，用蒸馏水稀释后，在室温条件下，用纳米激光粒度仪测定粒径及Zeta电位。样品平行测定3次。结果表明，平均粒径为(173.10±5.84)nm，多分散系数(polydispersity index，PDI)=(0.22±0.01)(n=3)，平均Zeta电位为(-27.47±0.40)mV(n=3)。

2.4GB含量测定方法

2.4.1质谱条件采用ESI-离子源，多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式扫描。GB：m/z423.1→366.9；去簇电压(decluster potential，DP)：-100 V；碰撞能(collision energy，CE)：-25 eV。GLY：m/z491.9→169.6；DP：-140 V；CE：-38 eV。

2.4.2色谱条件色谱柱：Waters ACQUITYTM BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流动相为甲醇∶超纯水(75∶25)，流速0.2 mL/min，柱温30 ℃，进样体积1 μL，得到色谱图。见图2。

2.4.3供试品制备精密称取GB标准品和GLY标准品，分别置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得GB储备液及GLY储备液。取GLY储备液，用甲醇稀释至100 ng/mL作为内标溶液。取GB储备液，分别用甲醇稀释至不同浓度(低、中、高浓度分别为20、50、160 ng/mL)作为质控样品。上述溶液配置完成后全部放置在4 ℃冰箱中备用。

2.4.4专属性分别配置GB标准品溶液(50 ng/mL)、GLY标准品溶液(100 ng/mL)、空白NLC溶液，及GB、GLY和空白NLC混合溶液，将空白NLC溶液及GB、GLY和空白NLC混合溶液用适量甲醇破乳后进样。结果表明,NLC制备材料对GB和GLY测定无干扰。

2.4.5标准曲线取GB储备液用甲醇稀释为浓度分别为10、20、50、100、200 ng/mL的系列溶液，分别按体积比3∶1加入内标溶液，混匀后进样，并分别计算GB、GLY峰面积。以GB与GLY峰面积之比(R)为纵坐标，浓度(c)为横坐标，R对c进行线性回归，得标准曲线。线性回归方程为R=0.020 3c+0.022 6，R2=0.999 3，结果表明，GB在10~200 ng/mL浓度范围内，峰面积之比与浓度呈良好的线性关系。

2.4.6精密度按“2.4.3”项下方法配置低、中、高浓度质控样品，每浓度平行配置5份。分别按体积比3∶1加入内标溶液，混匀后进样，考察日内精密度。连续测定3 d，考察日间精密度。结果表明，日内RSD均小于15%，日间RSD均小于12%。

2.5超滤离心法测定包封率

2.5.1不同截留分子量选择按“2.4.3”项下方法配置GB溶液(50 ng/mL)，分别向截留分子量为3、10、100 kD的超滤离心管中加入1 mL GB溶液，3 000 r/min离心10 min，收集滤液。将超滤前后GB溶液分别按体积比3∶1加入内标溶液，混匀后进样测定，计算不同截留分子量的超滤管对GB回收率影响。结果表明，GB溶液经3、10、100 kD超滤离心管超滤后回收率分别为(95.47±1.78)%、(101.32±3.93)%、(99.38±4.97)%，RSD(n=3)分别为1.87%、3.88%、5.00%。

2.5.2膜吸附率测定按“2.4.3”项下方法配置低、中、高浓度GB溶液，分别取1 mL加入超滤离心管(截留分子量：100 kD)中，3 000 r/min离心10 min，得滤液。将超滤前后GB溶液分别按体积比3∶1加入内标溶液，混匀后进样测定，计算超滤膜对不同浓度GB吸附程度。结果表明，低、中、高浓度样品在超滤膜平均回收率分别为(103.70±6.78)%、(102.68±11.52)%、(98.73±4.85)%，RSD(n=3)分别为6.53%、11.22%、4.91%。

2.5.3加样回收率按“2.4.3”项下方法配置低、中、高浓度GB溶液，与等体积空白NLC溶液混匀，取1 mL加入超滤离心管(截留分子量：100 kD)中，3 000 r/min离心10 min，得滤液。将超滤前后GB溶液分别按体积比3∶1加入内标溶液，混匀后进样测定，计算加样回收率。结果表明，低、中、高浓度样品平均回收率分别为(101.93±4.89)%、(99.65±6.47)%、(102.50±6.58)%，RSD(n=3)分别为4.80%、6.49%、6.42%。

3讨论

本实验采用乳化蒸发-低温固化法制得GB-NLC，从扫描电镜结果可以看出，制得的载药NLC多为类球形，粒径分布在100~200 nm之间，部分粘连可能是由于原始GB-NLC溶液未经稀释就进行烘干并拍摄导致。所测平均粒径为(173.10±5.84)nm，与扫描电镜结果相符，PDI=(0.22±0.01)(n=3)，表明分散性良好。测得平均Zeta电位为(-27.47±0.40)mV(n=3)，通常认为当纳米粒Zeta电位绝对值位于30 mV附近时有较好的稳定性。

超滤离心法被认为是测定包封率较为常用的方法。由于超滤膜对有机溶剂的耐受性有限，对于脂溶性强的药物，游离药物因在水中析出而堵塞超滤管，因此超滤离心法多用于具有一定水溶性药物的包封率测定。研究[12]表明，GB的脂水分配系数(lgP)为0.59，表明GB具有一定的水溶性，可用此方法进行后续试验。本实验首先考察了不同截留分子量的超滤管对GB回收率的区别，结果表明，GB在3种不同截留分子量的超滤离心管上回收率都大于95%。通过查阅资料[13]可知，截留分子量为100 kD的超滤膜，其膜孔平均直径为5.5 nm，已足够拦截制备的GB-NLC，考虑到较小截留分子量的超滤管使用过程中容易堵塞，因此选取截留分子量为100 kD的超滤管为后续实验所用。而膜吸附率实验和加样回收率实验结果则表明，无论是超滤离心管还是空白NLC对低、中、高浓度的GB溶液皆无明显吸附。

因此，采用超滤离心法测定GB-NLC包封率可获得重复性较好、准确度较高的结果，为GB-NLC处方优化提供支持。

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·方药研究·

Centrifugal Ultrafiltration Technique for Determining Entrapment Efficiency of Ginkgolide B-loaded Nanostructured Lipid Carriers

ZHOUKai1,YAOLiang1,DAIHao-zhi1,LINTong-yuan1,ZHUTing-ting1,XINGRong2,CHENWei-dong1

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,AnhuiBengbu233000,China)

收稿日期：(2014-08-11；编辑：曹健)

通信作者：陈卫东，anzhongdong@126.com

作者简介：周恺(1988-)，男，硕士研究生

[中图分类号]R944[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.02.023

Effects of Aqueous Extract ofAcorustatarinowiion PC12 Cell Proliferation and Processes

YAONa1,2,LIANGMi2,LINSen-xiang2,ZHANGQi2,TANYan2,WANGXu2,WANGShu-yan2,HUAQian2

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,TianjinBloodCenter,Tianjin300110,China; 2.SchoolofBasicMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)